处理加热过的肌肉蛋白质来识别肉的种类以及加热肉品终点温度的确定.pptVIP

时应选择杂交克隆分泌物，而且必须要经过仔细的镜检和亚克隆。对于准备抗原有两种方法:1)用蒸馏水或盐水对粗瘦肉进行搅拌，过滤物可以作为免疫原。 2）瘦肉混于0.15MNACL中，沸水加热并且离心.上层液121℃30分钟高温灭菌过滤，用90﹪乙醇进行萃取，沉淀，干燥物溶于盐溶液中备用。来自免疫老鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合后可作为杂交产物。在我们的实验室中， 遵 守由 Kohler 和Milstern描述的一般程序，那便是在随后 第二十九页，共五十九页。 的步骤中要进行必要的修饰。ELISA镜检是用于经过选择实验的与抗 原 对应的克隆体，同时用异种的浸提物和 别的食物蛋白通过交叉反应来稳定杂交 物。杂交产物具有我们所期望的特性 ， 之后通过限定性稀释程序对之克隆至 少两次以获得稳定的单克隆细胞链。SDS和 免疫点技术用于确 认 每种单克 隆肉类浸提物种抗原的成分。 第三十页，共五十九页。 3.2 单克隆抗体的特点 目前为止，五种免疫球蛋白单克隆抗体技术在实验中已用于掺杂肉种类的 检测。单克隆抗体2F8同五种经过加热的哺乳动物肉发生 十分强烈的反应 ，但不同任何加热的禽肉发生反应。3E12同禽肉 反应，5D2主要用于鸡和火鸡的鉴别中。9C6只特定于鸡，5H9只用于猪肉。 第一 组 四种单克隆抗体技术用于经水或盐水浸 提过的经过加热处理的肌肉蛋白，它 们 同 第三十一页，共五十九页。 特别的加热肉提取物发生了强烈的反应，但不同原料肉和加热处理后的肉相作用。免疫印迹结果表明所有的单克隆抗体同加热处理肉提取物中两条或更多条蛋白带发生反应，除了5H9以外，但它可检 测猪肉浸提物 中单一带。5H9也同原料猪肉浸提物的三个蛋白带发生反应，带有24KD的蛋白质可以被确认 为猪 肉特 定的热稳定肌肉蛋白。 第三十二页，共五十九页。 所有的单克隆抗体也发展成对骨骼肌具有特定的反应。表3说明了5H9对于不同猪肉组织和食物蛋白的免疫反应，也 同时说明了5D2的特性反应.这些单克隆抗体对于特定骨骼肌而具有的特点不同于别的已报道的结果，别的报道讲已观 察到这些抗体对器官，心肌，或平滑肌 的交叉反应。基于特定肌肉的单克隆抗体分析可以对样品中瘦肉进行定量分析 检测。对于定量分析来讲抗原均匀的分布在不同动物的半天肌肉组织中是十分 第三十三页，共五十九页。 重要的，所以抗原的量决定于同样品中一定目标肌肉组织的分析反应，而不用考虑肌肉切面的位置。单克隆抗体5H9 用于定量检测牛肉制品中不同切面的猪肉含量。无论是使用间接非竞争还是竞争性ELISA技术，都表示在肉不同的切 面整个浸提物蛋白浓度和猪肌肉组织得测定数量水平没有不同。这些结果暗示，由单克隆抗体5H9所检测得抗原组成对 于制造商十分的适用，它可用于定量检测肉样中猪瘦肉。 第三十四页，共五十九页。 表4 确认加热肉种类时作用于加热处理蛋白质的单克隆抗体的鉴别特性 ? 单克隆抗体类型 亚型 鉴别种类 抗原蛋白质分子重量（kD) 2F8 IgG2b 牛肉，猪肉，羊肉，马肉，鹿肉 18.5－26.5 3E12 IgG1 鸡肉，火鸡肉，鸭肉 22－34 5D2 IgG1 鸡肉，火鸡肉 22－35 第三十五页，共五十九页。 9C6 IgG1 鸡肉 120，33.5 5H9 IgG1 猪肉 24 第三十六页，共五十九页。 3.3掺杂肉类的检测 如表5所示，间接ELISA反应的吸光度或者竞争性ELISA反应所表达的抑制百分率和牛肉中猪肉的百分量对数之间存在线形关系。表6所展示的是使用间接和竞争ELISA应用单克隆抗体5D2来定量检测猪肉中鸡肉含量的药剂反应水平曲线,应用间接和竞争性ELISA系统来检测我们的单克隆抗体可以得到一致的结果，说明这些单克隆抗体在肉制品的快速检测或者掺杂肉种类的确认方面是十分有效的。 第三十七页，共五十九页。 检样掺杂违规程度的判断受限于分析方法所能达到的最低检测水平，应用传统的琼脂胶体检测方法，它的最低检测量通常在5－10﹪。ELISA的应用已经提高了检测能力，但不能检测肉样中含量十分低的掺杂肉类。 采用了我们的分析程序，这些分析方法对于掺杂 种类含量的检测能力在0.5－1 ﹪之间,可以同大多的已报道的用于肉种 类确认的ELISA方法相比。对于实际应用来讲， 掺杂肉1﹪的检测 能 力 对于官方的常规分析检测已足够。 第三十八页，共五十九页。 现在确认肉种类的商业ELISA方法一次只能对单一的种类进行定量检测。如果把之应用到管理当中，使用这些ELISA方 法来检测大量样品中复杂的肉种类是十分费时的而且花费十分大，如果用单一检测方法来区分不同肉的种类会更昂 贵更费力。例如应用单克隆抗体2F8来检测加