第五章分子生物学研究方法.pptVIP

5·4·2 重组体DNA分子的构建 1·外源DNA片段定向插入载体分子： 载体分子和待克隆的DNA分子都是用同一对(NE1和NE2) 切割，二者将按一种取向退火形成重组DNA分子，保证外源DNA片段定向插入载体分子。 若载体分子和外源DNA插入片段不能产生出互补的粘性末端，则采用附加衔接物的办法来提高平末端之间的连接效率。 第六十二页，共八十七页。 具体说：首先将含有待扩增DNA样品的反应混合物放置在高温(约94℃)环境下加热1min，使双链DNA变性，形成单链模板DNA；然后降低反应温度(约56℃)制冷1min，使引物与两条单链模板DNA发生退火作用并结合在靶DNA区段两端的互补序列位置上；最后，72℃左右保温1至数分钟，在DNA聚合酶的作用下，从引物的3’-端加入脱氧核苷三磷酸，并沿着模板按5’→ 3’方向延伸，合成新生DNA互补链。以上循环在同一个PCR管中进行。反应物加完后，温度由PCR仪调整，程序完成后可以拿到产物。 第三十页，共八十七页。 5·3 基因克隆的主要载体系统5·3·1 质粒DNA及其分离纯化 细菌质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体并能自主复制的遗传成分，质粒都是由环形双链DNA组成的复制子（有少量线性质粒、RNA质粒报道）。质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外的游离状态，也可能在一定的条件下被可逆性整合到寄主染色体