探讨酸浆水中的微生物鉴定中高通量测序技术的应用.docVIP

探讨酸浆水中的微生物鉴定中高通量测序技术的应用 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：探讨酸浆水中的微生物鉴定中高通量测序技术的应用 1 1、材料与方法 2 [2，3，4，5] 2 2、结果与分析 3 3、结论与讨论 6 文2：自然流产遗传病因的高通量测序检测 6 1 资料与方法 6 2 结果 7 3 讨论 8 参考文摘引言： 10 原创性声明（模板） 11 文章致谢（模板） 12 正文 探讨酸浆水中的微生物鉴定中高通量测序技术的应用 文1：探讨酸浆水中的微生物鉴定中高通量测序技术的应用 以酸浆水为点浆水制作的酸浆豆腐，是山西大同最北部广灵县的特色。酸浆水为淡黄色液体，澄清透明，味道偏酸，是由当地沿用原有的发酵液，通过向其中不断补充新鲜的水，并露天自然发酵而成。由此制作而成的豆腐，不仅有浓郁的豆香，而且有独特的酵香，推测这可能与酸浆水中含有的微生物有关。关于酸浆水中微生物的组成情况，国内外报道较少，因此本文将通过高通量测序技术对酸浆水中的微生物组成情况进行分析，并运用传统的分离纯化方法和试剂盒鉴定酸浆水中的微生物。 1、材料与方法 材料与设备 取自山西省大同市广灵县某豆业有限公司的新鲜酸浆水，取澄清透明、无泡沫的酸浆水于无菌离心管中，低温贮藏运送至实验室。 细菌培养基：营养琼脂、营养肉汤。 分离乳酸菌用培养基：M琼脂培养基、M肉汤培养基，购于索莱宝生物科技有限公司。 API50CHL乳杆菌鉴定试剂盒[1]：购于法国生物梅里埃（中国）有限公司。 SW-CJ-2FD双人单面净化工作台苏州净化设备有限公司；HPP-9272电热恒温培养箱北京东联哈尔仪器制造有限公司；立式压力蒸汽灭菌器上海博讯实业有限公司医疗设备厂；BS224S电子天平北京赛多利斯仪器系统有限公司；μm×25mm针式过滤器及相应规格滤膜颇尔（中国）有限公司。 方法 [2，3，4，5] 在超净工作台的无菌环境中，将酸浆水原液利用针式过滤器收集在滤膜上，共收集10片滤膜，密封于无菌塑封袋中，置于-80℃保存，之后低温运送至美吉云生物公司进行检测。 取酸浆水于营养肉汤培养基中进行扩大培养，37℃恒温培养48h，使微生物富集。 取扩大培养后的原液转入营养琼脂培养基中，采用平板划线法培养，37℃恒温培养24h。待菌落长出，挑取单菌落使用营养肉汤培养基进行扩大培养，37℃培养24h。再转为营养琼脂培养基进行分离筛选[6]，直至长出单菌落。 取经细菌培养基分离筛选的细菌转入M琼脂培养基进行平板划线培养。分成两类培养，一类为好氧培养，另一类为厌氧培养。两种培养均需在37℃恒温培养24h。待菌落长出，挑取单菌落用M肉汤培养基进行扩大培养，37℃恒温培养24h。再将其转入M琼脂培养基进行分离纯化[7]，重复此操作3次。 取菌落分散性较好、单一菌落丰富的培养皿，对其进行菌落的培养特征观察[8] 使用APICHL培养基和API50CH试剂条对菌株进行49项生化试验鉴定，置于37℃恒温培养24，48h。 2、结果与分析 高通量测序结果分析 通过对高通量测序技术数据进行处理与分析，得到酸浆水中微生物的分类组成情况。 通过聚类操作，对样本所有序列进行OTU划分，并对97%相似水平下的OTU进行生物信息统计分析，可得到一个样本测序结果中菌种和菌属的数目情况。从科水平到种水平的OTU总数表见表1，共有10个科，13个属，17个种，其中有7个属没有注释到种水平。伯克氏菌科的OTU总数为28，醋酸杆菌科的OTU总数为544，乳杆菌科的OTU总数为43318，诺卡氏菌科为6，丙酸杆菌科为2，葡萄球菌科为19，纤细杆菌目为8，莫拉氏菌科为5，交替单胞菌科为5，色杆菌科为9。结果表明：从科水平、属水平到种水平，乳酸杆菌的OTU总数都处于优势地位。 表1从科到种的OTU总数表 基于OTU数据表，利用R语言工具作图，在属水平上统计样本的物种组成以及各物种的相对丰度，可制得群落饼图，见图1。酸浆水中的微生物群落中，乳酸杆菌属（Lactobacillus）的物种丰度为43318，占比%；醋酸杆菌属（Acetobacter）的物种丰度为544，占比%；其他菌属的物种丰度为82，占比%。同样地，基于OTU数据表，选择属水平上分类信息对应的序列，根据最大似然法ML(maximumlikelihood），可构建属水平上的系统发育树，见图2。 图1属水平上的物种丰度饼图 图2属水平上的系统发育树 由图2可知，酸浆水中的微生物群落从属水平上可大致分为三类：一类是乳酸杆菌属，一类是由同一结点进化分支，两两之间互有亲缘关系的菌属，包括醋酸杆菌属、罗尔斯通氏菌属福格斯氏菌属、球衣菌属、纤毛菌属、莱茵海默氏菌属、不动杆菌属、