线粒体靶向KillerRed增强辐射诱导HeLa细胞线粒体失能及细胞自噬作用研究.docVIP

线粒体靶向KillerRed增强辐射诱导HeLa细胞线粒体失能及细胞自噬作用研究 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：线粒体靶向KillerRed增强辐射诱导HeLa细胞线粒体失能及细胞自噬作用研究 1 1、材料与方法 2 2、结果 4 3、讨论 6 文2：激不可失励所能及 7 参考文摘引言： 11 原创性声明（模板） 12 文章致谢（模板） 13 正文 线粒体靶向KillerRed增强辐射诱导HeLa细胞线粒体失能及细胞自噬作用研究 文1：线粒体靶向KillerRed增强辐射诱导HeLa细胞线粒体失能及细胞自噬作用研究 活性氧（reactive oxygen species，ROS）是一类由线粒体产生的活性分子，作用于线粒体后可以导致线粒体膜电位（mitochondrial membrance potential，MMP）的降低和线粒体呼吸链的损伤，进而引起线粒体失能，并诱导细胞自噬[1，2，3]。本课题组前期研究[4，5]显示：线粒体靶向KillerRed(mitochondrion-targeted KillerRed，mtKR）可以增强辐射所致的细胞增殖抑制和凋亡，但其具体机制尚未明确。在本研究中，以构建的mtKR质粒Pink1-mtKR转染宫颈癌HeLa细胞，采用可见光和4Gy X射线联合照射后，检测细胞MMP和氧化呼吸链复合物Ⅰ和Ⅲ的活性等功能指标，并检测自噬和PTEN诱导假定激酶1/帕金蛋白（PTEN-induced putative kinase 1/parkin，Pink1/parkin）调控通路相关蛋白表达，阐明mtKR对辐射诱导的线粒体失能和细胞自噬的作用，探讨其相关的分子调控机制，为增强宫颈癌放疗效果提供新思路。 1、材料与方法 细胞、主要试剂和仪器 人宫颈癌HeLa细胞由本实验室保存。MEM完全培养基（美国Gibico公司），Hieff TraTM脂质体核酸转染试剂（上海翊圣生物科技有限公司），青、链霉素（美国Thermo Fisher Scientific公司），罗丹明123、线粒体呼吸链复合体Ⅰ和Ⅲ水平检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司），单丹磺酰尸胺（monodaylcadaverin，MDC，美国Sigma公司），线粒体分离试剂盒（碧云天生物技术有限公司），Pink1、parkin和线粒体外膜转位酶20(tracocase of outer mitochondrial membrance20，Tom20）多克隆一抗（美国ImmunoWay公司），P62多克隆一抗（美国CST公司），热休克蛋白60(heatshock protein 60，Hsp60）和GAPDH兔多克隆一抗（美国Bioworld公司），辣根过氧化物酶标记的二抗（美国Santa Cruz公司），其他试剂均为国产分析纯。多功能微孔板检测仪（美国Biotek公司），X射线辐照仪（型号X-RAD 320iX，美国Precision X-ray股份有限公司） 实验分组和照射 HeLa细胞分为对照组、空载体组、Pink1-mtKR组、对照+4Gy X射线照射组、空载体+4Gy X射线照射组和Pink1-mtKR+4Gy X射线照射组。无菌条件下避光可见光源照射细胞[5]，时间为30min，12h后X射线照射，条件为电压180kV，电流，靶皮距70cm，剂量率·min-1，单次照射剂量为4Gy。 流式细胞术检测细胞MMP和自噬率 取对数生长期的HeLa细胞接种于24孔板中，细胞密度为×105个/孔，瞬时转染空载体和Pink-mtKR质粒，30h后给予30 min可见光照射，12h后进行4Gy X射线照射，于24h时收集各组细胞，PBS洗涤3次。检测MMP时，加入300μL PBS，重悬细胞，加入罗丹明123（终浓度5μmol·L-1）于37℃避光反应30min，上机检测，以平均荧光强度（mean fluorescence inteity，MFI）表示MMP。加入10 mLMDC(5mmol·L-1)，37℃静置30 min后，1 000r·min-1离心5min，弃废液，加入4%多聚甲醛1mL避光条件下固定15 min，离心后加入PBS洗涤1次，上机检测细胞自噬率。 细胞中线粒体呼吸链复合物Ⅰ和Ⅲ水平检测 HeLa细胞瞬时转染后，进行可见光照射和4Gy X射线照射，24h后按5×107个细胞加入提取液的比例加入提取液，用匀浆器在冰上匀浆，按照试剂盒说明书提取线粒体蛋白，并分别按照试剂盒说明书检测线粒体呼吸链复合物Ⅰ和Ⅲ水平。 Western blotting法检测细胞中Pink1、parkin、P62和Tom20蛋白表达量 HeLa细胞进行瞬时转染