内皮祖细胞在阿尔茨海默病外周血中的数量及功能研究.docVIP

内皮祖细胞在阿尔茨海默病外周血中的数量及功能研究 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：内皮祖细胞在阿尔茨海默病外周血中的数量及功能研究 1 一、研究对象 2 二、研究方法 2 1.临床资料的收集 2 2.量表评价 3 3.人外周血EPC的分离和培养 3 4.流式细胞仪测定外周血EPC数量 3 三、统计学处理 4 文2：脑脊液酶谱在阿尔茨海默病中的研究进展 7 参考文摘引言： 9 原创性声明（模板） 10 文章致谢（模板） 10 正文 内皮祖细胞在阿尔茨海默病外周血中的数量及功能研究 文1：内皮祖细胞在阿尔茨海默病外周血中的数量及功能研究 阿尔茨海默病（AD）是最常见的老年期痴呆类型，其所致的渐进性记忆障碍、日常生活能力下降及精神行为异常给社会及家庭带来了沉重的负担，是人类所面临的最大的全球公共卫生事件[1]。目前AD的病因仍不明确，尽管神经变性机制是最被公认的机制之一，但仍存在不能通过变性机制可以解释的地方，例如AD患者合并血管相关基础疾病的比例更高，而发生过血管病变患者的AD进展会更快[2，3]。血管学说在AD的致病机制中的作用越来越受到重视，对AD机制的研究可为AD的预防和治疗提供更多的线索依据。内皮祖细胞（EPC）能直接反映血管内皮功能的指标，其数量和功能的减低提示血管内皮功能失调及血管修复能力下降[4]。本研究旨在分析EPC在不同严重程度AD患者外周血中的表达，以探讨AD潜在的发病机制。 对象与方法 一、研究对象 选择2018年10月至2019年12月广州市老人院失智老人照顾中心及中山大学附属第一医院东院神经内科收治的58例AD患者（研究组），均符合2011年美国国立老化研究所和AD协会（NIA-AA）提出的很可能AD诊断标准[5]。另选择同期在中山大学附属第一医院东院因其他原因住院、经痴呆分级评定量表（CDR）判定为无痴呆的18名志愿者为正常对照组。排除标准：(1)近3个月内有新发心肌梗死、外周血管栓塞、外伤、手术事件者；(2)未获控制的内科疾病如中枢或外周感染、严重高血压病、全身代谢紊乱等；(3)脑梗死、抑郁症、药物滥用所致的认知功能下降。本研究已经征得入组者及其家属或代理者的知情同意。 二、研究方法 1.临床资料的收集 收集所有受试者的病历资料，记录性别、年龄，是否合并高血压病、糖尿病、冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）、高脂血症，以及头颅影像学等资料，并采集受试者空腹血糖、总胆固醇、LDL-C等血液学检查资料。符合入组标准的受试者以肝素抗凝管于清晨空腹采集外周静脉血15ml用于EPC的相关实验室检测。 2.量表评价 采用CDR对受试者本人及其照料知情者进行访谈[6，7]。采集其关于记忆、定向、判断解决问题能力、社会事务、家务及业余爱好、个人自理6个方面的资料，将受试者分为无痴呆、轻度痴呆、中度痴呆、重度痴呆共4组。量表评估均由经过痴呆相关量表培训且有多年痴呆诊治经验的神经内科医师完成。 3.人外周血EPC的分离和培养 Ficoll密度梯度离心法提取外周血单个核细胞：取外周静脉血，用等体积磷酸盐缓冲液（PBS）稀释后，小心加入至含人淋巴细胞分离液的离心管上层，2000转/分离心15min，用玻璃吸管小心吸取中层白色雾状的单个核细胞层，PBS洗涤2次后，离心10min获取单核细胞，将单核细胞重悬于含10%胎牛血清的EPC全培养基，置37℃，每4d换液1次，培养1周。 4.流式细胞仪测定外周血EPC数量 取200μl外周血，依次加入胎肝激酶-1(FLK-1）流式细胞荧光抗体一抗、FLK-1二抗、CD34流式细胞荧光抗体分别进行孵育各20min。加入2ml红细胞裂解液，梯度离心5min，弃上清后再次离心4min，剩余细胞以2%多聚甲醛固定，以流式细胞仪检测CD34/KDR双阳性细胞即EPC的数量。 迁移功能检测 在避光培养的EPC板中加入10μl活细胞染色剂CM-Dil及内皮细胞培养基，于培养箱中放置5min后，弃EBM-2，加入%胰蛋白酶消化6min，弃上清，PBS清洗2次；加入EBM-2400μl重悬已染CM-Dil的EPC，进行细胞计数，统一数量为1×104/ml；将其加入Trawell上室，悬浮在500μlDMEM培养液的下室之上，培养24h后，轻擦掉上室膜上未迁移的细胞，随机选取5个显微镜200倍视野，计数迁移的细胞并取平均值。 黏附功能检测 将EPC传代于6孔板48h后，弃培养基，以PBS洗2次，加入500μlDAPI荧光染料孵育5min，弃DAPI，PBS清洗2次后，将CM-Dil标记的同等数目2mlEPC悬液加入其中，37℃孵育3h，然后吸去培养液，以2ml4%PFA固定液处理10min