第二节植物细胞工程.pptVIP

植物细胞培养 植物细胞培养是指在离体条件下，将愈伤组织或其他易分散的组织置于液体培养基中进行振荡培养，得到分散成游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖，从而获得大量细胞群体的一种技术。其理论基础是植物细胞具有全能性。 第三十一页，共六十一页。 植物细胞培养的方法 根据培养对象，植物细胞培养可以分为单细胞培养、单倍体培养和原生质体培养。单倍体培养主要指花药培养。 按照培养系统可分为悬浮培养、液体培养、固体培养、固定化培养等。 第三十二页，共六十一页。 植物细胞培养的培养基 植物细胞培养基比动物的简单，主要由无机盐、碳源、维生素、植物生长激素、有机氮源、有机酸和一些复合物组成。 无机盐类：浓度为25 mmol/L左右。必须有钾元素，浓度为20 mmol/L或更高。 碳源：蔗糖或葡萄糖是常规的碳源，果糖差一些。 第三十三页，共六十一页。 植物生长激素：生长素或细胞分裂素。生长素促进细胞分裂，促使根形成；IAA，2，4-D，NAA，IBA。细胞分裂素是BA和玉米素。 有机氮源：主要有蛋白水解产物，谷氨酰氨或氨基酸混合物。 有机酸： 复合物质：椰子汁 第三十四页，共六十一页。 培养基的准备 高纯度的药品 应用蒸馏水或高纯度的去离子水 调pH值 高温灭菌（120 0C 15-20 min） 某些药品需用过滤除菌 需配高浓度母液 第三十五页，共六十一页。 植物单细胞培养 主要是观察细胞个体是如何进行分裂、分化、生长及发育为大规模培养奠定基础。 单细胞制备方法： 机械化：效率低，获得的细胞数量有限。 酶解法：最为有效的一种获得单细胞的方法。可用来制备原生质体。 愈伤组织诱导法： 第三十六页，共六十一页。 单细胞培养方法 平板培养法：将一定量细胞接种到或混合到装有一薄层固体培养基的培养皿内进行培养。具体步骤为：1）单细胞悬浮液的制备并记数；调节细胞密度；浇平板；接种培养。 看护培养和饲养层培养法 （1）看护培养：看护培养由Muir于1953年创立，是指用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，使其持续分裂和增殖的一种培养方法。这快愈伤组织被称为看护组织。具体方法是将单个细胞接种于滤纸上，再置于愈伤组织之上培养。优点是简便、成功率高。缺点是不能在显微镜下直接观察。 第三十七页，共六十一页。 饲养层培养：是用处理过的无活性的或分裂很慢，不具备分裂代谢能力的细胞来饲养所需培养的细胞，使其分裂和生长。 液体潜层静置培养法：将一定密度的悬浮细胞放在培养皿中形成一浅薄层，封口静止培养。优点是易于补加新鲜培养基，可以镜检。 细胞悬浮培养法：细胞接种于液体培养基中，在保持良好的分散状态情况下培养。 第三十八页，共六十一页。 悬浮培养的细胞优点是： 能大量提供比较均匀的细胞。 细胞营养吸收、环境条件好，细胞增殖快。 适合大规模培养，生产有价值的活性代谢产物。 细胞生长测定的方法有： 细胞记数 细胞体积 细胞鲜重和干重 第三十九页，共六十一页。 悬浮细胞培养的同步化方法 物理方法：体积选择法和冷处理法 化学方法：饥饿法、抑制法和有丝分裂抑制法 第四十页，共六十一页。 细胞的保存 继代培养保存法 低温保存法 冰冻保存 第四十一页，共六十一页。 植物原生质体培养 将植物细胞壁除去后得到的裸露的球形细胞,即为原生质体. 特点: 无细胞壁障碍,可以方便地进行有关遗传操作,并且对膜和细胞器等进行研究. 具有全能性,并能进行人工培养发育成完整植株. 原生质体适合进行诱导融合形成杂种细胞. 第四十二页，共六十一页。 科研和生产用途 提供生理生化研究的材料. 用作研究基因调控和表达,遗传工程研究的材料. 进行原生质体融合,建立杂交品种;同时可研究染色体行为和基因定位等. 进行细胞器的分离,或进行相关细胞器的遗传实验. 第四十三页，共六十一页。 发展历史 19世纪30年代Schwann 和Schleidn创立细胞学说，认为植物和动物都是由细胞构成。 1943年，美科学家White正式提出植物细胞具有全能性的学说，认为每个植物细胞具有该植物的全部遗传信息和发育成完整植株的能力。 1934年，荷兰植物学家Went等发现了生长素，随后又发现了其它生长素。 1948年，斯科克等较好地解决了如何从离体组织或器官中诱导植物再生的问题，并确定了腺嘌呤/生长素的比例是控制芽和根形成的一个重要条件。 第一页，共六十一页。 1953年，Muir开创了建立单细胞无性繁殖的工作。 1956年，Miller发现了激动素 1958年，Steward等从胡萝卜根韧皮部愈伤组织获得单细胞，并经诱导形成胚状体再生了植株，这是世界上首次通过实验证实了植物细胞具有全能性。 20世纪六十年代中后期，植物组织培养进入大规模的应用阶段。1960