口腔鳞状细胞癌患者外周血差异表达的miRNA及预后意义.doc

口腔鳞状细胞癌患者外周血差异表达的miRNA及预后意义 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：口腔鳞状细胞癌患者外周血差异表达的miRNA及预后意义 1 1、对象与方法 2 2、结果 4 3、讨论 6 文2：大肠癌患者外周血微转移与化疗及预后的关系 7 1 材料与方法 8 2 结 果 9 3 讨 论 10 参考文摘引言： 12 原创性声明（模板） 13 文章致谢（模板） 13 正文 口腔鳞状细胞癌患者外周血差异表达的miRNA及预后意义 文1：口腔鳞状细胞癌患者外周血差异表达的miRNA及预后意义 口腔癌属于头颈部肿瘤，而口腔鳞状细胞癌(Oral squamous cell carcinoma，OSCC)是主要的组织学类型，占口腔癌的95%[1]。尽管取得了巨大的治疗进展，但OSCC的5年生存率仍然很低[2]。OSCC预后不良的主要原因是大多数患者无症状，常在晚期诊断。因此开发可靠的生物标志物对早期发现OSCC具有重要意义。 MicroRNAs(miRNAs)是一类长度约为19～25个核苷酸的内源性单链非编码RNA[3]。他们通过互补结合靶mRNA的3’非翻译区来负性调控基因表达。miRNAs在增殖、分化和凋亡等重要的细胞功能中起关键作用。miRNA在人类肿瘤中异常表达，作为癌基因或抑癌基因在肿瘤的发展过程中发挥作用[3] miRNA的异常导致了OSCC肿瘤的发生[4]。为了进一步筛选口腔鳞状细胞癌患者外周血差异表达的miRNA，本研究利用qRT-PCR技术检测OSCC患者外周血中miRNA的变化，进一步扩大样本量进行验证，并分析miRNA与OSCC患者临床病理指标和预后的关系。 1、对象与方法 研究对象 正常对照组的血液样本取自石家庄市常住人口的志愿者;实验组的血液样本取自2014年5～12月于河北医科大学第四医院口腔科就诊的口腔颌面部鳞状细胞癌患者。其中实验组患者未进行任何特殊治疗且均有病理学诊断依据，并且排除其它系统肿瘤或和口腔转移性肿瘤的情况。正常志愿者血液样本3例，口腔颌面部鳞状细胞患者血液样本63例。所有志愿者和患者均签署知情同意书，并获得河北医科大学第四医院伦理委员会的批准。于清晨空腹抽外周静脉血2 mL，予抗凝处理，-80℃保存。 血清总RNA提取及反转录 用miRNeasy Serum/plasma Kit血液总RNA提取试剂盒(QIAGE)提取总RNA，利用miRNeasySerum/Plasma Spike-In Control(QIAGE)进行总RNA纯化，置于-80℃保存。ND-2000超微量分光光度计检测标本浓度，根据A值的比值:A260∶A280检测总RNA的纯度，该值在～之间表明总RNA纯度较高，符合要求。按照反转录试剂盒(miScript II RT Kit，QIAGE)的说明书进行总RNA的逆转录以用于后续实验。 miRNA微阵列检测及结果判定 血清与血浆miRNA PCR芯片Serum Plasma miScript miRNA Array购自德国QIAGE公司。qRT-PCR反应体系的配制:2×Quanti TectSYbr Green PCR Master Mix 1375μL，10×miScript Univeeral primer 275μL，Template cDNA 100L，加Nuclease-Free Water至总体积2750μL。充分混匀，于96孔板中每孔加入25μL。进行qRT-PCR扩增，反应条件为:95℃15 min预变性，94℃15 s变性，55℃30 s退火，70℃30 s延伸，变性至延伸过程共40循环。miRNA的相对表达量用2-△△Ct(Fold Change值)来表示，其中作为内参。实验重复3次，结果取平均值。Fold Change大于2表明实验组中miRNA表达水平较对照组的上调且有意义。Fold Change小于表明实验组中miRNA表达水平较对照组的下调且有意义。 实时定量PCR验证基因芯片的结果 外周血按照上述方法提取血清总RNA及反转录，引物采用10×miScript Primer Assay(德国QIAGE公司)。反应体系为25μL，其中包括μL 2×Quanti Tect SYbr Green PCR Master Mix，μL 10×miScriptUniveeral Primer，μL 10×miScript Primer Assay，μL Template cDNA，加Nuclease-FreeWater至总体积25μL。充分混匀，进行qRT-PCR扩增，反应条件如上所述。miRNA的相对表达量用2-△△Ct(Fold Ch