探究利用羊水干细胞分化代替受损神经元设想的实现（生物学资料）.docVIP

探究利用羊水干细胞分化代替受损神经元设想的实现（生物学资料） 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：探究利用羊水干细胞分化代替受损神经元设想的实现 1 1、材料和方法 3 2、结果 6 3、讨论 8 文2：受损背根节神经元持续性钠流的检测 12 1材料和方法 12 参考文摘引言： 15 原创性声明（模板） 17 文章致谢（模板） 17 正文 探究利用羊水干细胞分化代替受损神经元设想的实现（生物学资料） 文1：探究利用羊水干细胞分化代替受损神经元设想的实现 文章快速阅读： 文题释义： 羊水干细胞：羊水是由多种细胞组成的异质细胞群，其中包括胎儿脱落的表皮细胞、呼吸道上皮细胞、消化道和泌尿道等体腔管道的脱落细胞、羊膜脱落细胞等。羊水中包含有向内、中、外3个胚层分化潜能的干细胞，约占1%，近年来研究发现羊水干细胞在体外通过特殊的诱导微环境能够分化成多种不同类型的细胞，使羊水来源干细胞成为干细胞研究的一个新热点。 悬滴培养：与传统的二维培养模式不同，悬滴培养提供的三维环境有利于促进各种干细胞的增殖与分化，可以使细胞聚集，相互紧密接触，从而促进细胞之间的相互作用，进而提高或增强干细胞的生物学功能。羊水干细胞悬滴培养可形成拟胚体结构，具有较强的分化潜能，有助于提高定向诱导分化效率。 神经元细胞在炎症、退化、药物毒性、理化、外伤等诸多因素作用下，可能出现变性、脱髓鞘、凋亡等不同程度的退化或死亡。由于神经元及胶质细胞的分化程度高，一旦损伤往往难以修复，甚至不可逆。神经元的病变如累及中枢神经系统，表现为帕金森病；如累及外周感觉神经(听觉平衡系统等)，表现为神经性耳聋、眩晕、耳鸣等症状。神经性耳聋为耳科临床上常见的疾病之一，目前减缓损伤或保护神经元的药物(例如糖皮质激素、神经生长因子)总体效果不理想；人工耳蜗植入或助听器能在一定程度上改善耳聋患者的听力，但前提是耳聋患者具有完整的功能性螺旋神经元结构。对由于螺旋神经元损伤导致的神经性耳聋患者，其临床治疗策略仍需要进一步的深入研究。 利用干细胞分化代替受损神经元的设想[1，2，3，4，5，6，7]，逐渐受到越来越多科研工作者的关注。胚胎干细胞和诱导性多能干细胞虽然具有良好的神经元分化潜能[8，9]，但由于接种活体动物具有致瘤性，限制了胚胎干细胞的进一步深入研究。2007年，DECOPPI等[10]在《NatureBiotechnology》杂志中首次提出羊水细胞中含有c-Kit标记的干细胞，具有全能干细胞的特性[11，12，13，14]，已证实在体外可成功诱导分化为3个胚层组织，包括肝细胞、内皮细胞、脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、平滑肌细胞等。较之胚胎干细胞，羊水干细胞又具有来源易取、无致瘤性等特点。 从神经性耳聋的治疗角度出发，课题组前期采用内耳支持细胞和羊水干细胞三维培养模式，发现羊水干细胞可分化为听觉神经元样细胞，初步具备螺旋神经元特性[15]，研究重点围绕内耳支持细胞的促分化作用展开介绍。羊水干细胞在今后神经元疾病治疗的前景广阔，但由于前期的分化方式较复杂，例如内耳支持细胞获取困难、数量有限，难以利用三维培养模式诱导羊水干细胞获取足够数量的神经元。因此课题组结合前期经验进行拓展研究，探讨有无其他方式可诱导羊水干细胞向神经元样细胞定向分化，以及建立稳定的分化体系，为神经元的再生提供参考依据。 1、材料和方法 设计 细胞学体外观察实验。 时间及地点 实验于2015年10月至2019年3月在广州医科大学附属第二医院过敏反应实验室完成。 材料 羊水取自广州医科大学附属第二医院的产前检查孕妇，夫妻双方均签署了知情同意书。在孕19-22周期间，经B超引导下抽取孕妇羊水10mL。广州医科大学附属第二医院医学伦理委员会审核并同意此项研究。 α-MEM培养基、DMEM/F12培养基、胎牛血清、谷氨酸、N2、B27(GIBICO公司)；ChangB、ChangC(IrvineScientific公司)；碱性成纤维细胞生长因子、脑源性神经营养因子、神经营养因子3(RDSystem公司)；Sox2、Tuj1一抗(Abcam公司)；c-Kit磁珠抗体(MiltenyiBiotec公司)；Oct-4、NeuroD一抗(Santacruz公司)；荧光显微镜下(Leica，德国) 方法 将孕19-22周10mL羊水移入15mL离心管，2000min离心5min；吸除上清液，加入4mL羊水干细胞增殖培养基(α-MEM培养基+体积分数为15%胎牛血清+1%谷氨酸+18%ChangB+2%ChangC)接种于25cm2培养瓶，置入37℃，体积分数为5%CO2培养箱内，培养7-9d。第7天，根据羊水贴壁细胞的增殖情况进行全量换液，加入4