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过氧化物酶指示系统 血清总胆固醇氧化酶测定法 胆固醇酯 + H2O 胆固醇 + O2 胆固醇 + 脂肪酸 △4-胆甾烯酮 + H2O2 红色醌类化合物 H2O2 + 4-AAP + 酚 指示酶反应生成的红色醌类化合物可在500 nm 处比色测定 * 第三十张，课件共五十七张，编辑于2022年5月 化学名 英文缩写 最大吸收峰（nm） 酚 2，4-二氯酚 N-乙基-N-（3-甲苯）-N-乙酰乙二胺 N-乙基-N-（2-羟基-3-丙磺酰）间甲苯胺 N-乙基-N-（3-丙磺酰）-3，5二甲氧基苯胺 P 2，4-DCP EMAE TOOS ESPDMA 500 510 555 555 585 过氧化物酶指示系统 常用的Trinder反应生色基团 　　表内这些酚类衍生物，有的是提高生色基团的稳定性和溶解度、产物的灵敏度和稳定性；有些生色基团的产物是兰色醌类，能避免溶血等色素干扰。 * 第三十一张，课件共五十七张，编辑于2022年5月 　　利用底物和辅酶的反复反应，使待测物的酶促反应产物不断扩增，扩增量决定于循环次数，反应产物的增加，提高了检测灵敏度，减少了共存物质的干扰，达到高灵敏度和特异的要求。 　　酶循环法(enzymatic cycling assay)的灵敏度决定于循环反应速度和时间，循环反应速度又取决于两种试剂酶( Ea 和Eb) 的量。该法测定中所选择酶的Km 值要小，以便用较少的酶量保持所需的灵敏度。 酶循环法 (3) * 第三十二张，课件共五十七张，编辑于2022年5月 使用两种酶，即一种氧化酶用于靶物质的氧化，一种脱氢酶使其回到还原状态，促使靶物质(或其衍生物)或靶物质的氧化产物作为底物循环。 检测指示系统： ①循环前、后用速率法测定NADH(340 nm) 的变化。②检测产物H2O2可通过Trinder 反应比色测定。 产物循环－氧化酶－脱氢酶系统 * 第三十三张，课件共五十七张，编辑于2022年5月 产物循环－氧化酶－脱氢酶系统 甘油浓度测定 通过GPO和G-3PDH使G-3P 与DHAP之间循环，在反复循环中G-3P 和DHAP 的量不变，而产物H2O2 随每次循环不断递增，同时NADH 递减。在规定时间t 内，H2O2 累计的量决定于t 和每min循环次数。 * 第三十四张，课件共五十七张，编辑于2022年5月 底物循环－脱氢酶－辅酶系统 用一种脱氢酶和两种辅酶( thio-NAD+ 和NADH)。用395 nm ～415 nm 波长测定反应中氧化型thio-NAD+ 转为还原型thio-NADH的增加速度。 循环反应条件： 酶对thio-NAD+ 和NADH应有高度亲和力。 溶液pH 和缓冲体系同时有利于双向反应。 thio-NAD+ 和NADH 二者的浓度和配比达最适条件。 * 第三十五张，课件共五十七张，编辑于2022年5月 底物循环－脱氢酶－辅酶系统 血淸胆汁酸测定 　　胆汁酸与3-酮类固醇之间构成循环，不断产生硫代还原型辅酶Ⅰ（黄色），控制好条件，反应速度与代测物胆汁酸呈正比。灵敏度可增加数十倍。 * 第三十六张，课件共五十七张，编辑于2022年5月 氨循环－合成酶－脱氢酶系统 NH4+在NAD合成酶和Mg2+存在下催化脱氨-NAD转化为NAD+，经脱氢酶将亮氨酸转化为氧化异己酸和NH4+同时生成NADH，生成的NH4+进入循环再次生成NADH，在340nm测定。 * 第三十七张，课件共五十七张，编辑于2022年5月 酶循环法具有的特点 灵敏度随反应时间的延长而提高 灵敏度随酶在扩增反应中的用量而提高 利用酶对底物的特异性,使测定系统简化 利用四唑盐类的显色反应可实现比色测定 * 第三十八张，课件共五十七张，编辑于2022年5月 酶活性恢复法 很多酶必需某些无机离子、微量元素或辅酶存在才发挥其催化活性。脱去酶中关键的无机离子、微量元素或辅酶之后，酶即失去了其催化活性，无活性的酶与标本混合，标本中的无机离子、微量元素或辅酶使该酶重新复活，复活的比例可以反映这些无机离子、微量元素或辅酶的含量。 其他酶法 (4) * 第三十九张，课件共五十七张，编辑于2022年5月 异柠檬酸脱氢酶法测定血清镁离子 酶活性恢复法 异柠檬酸+ NADP+ α-酮成二酸 + CO2 + NADPH+H+ 用EDTA和乙二醇二乙醚二胺四乙酸(GEDTA) 抑制钙离子，标本中Mg2+通过恢复ICD 活性，催化异柠檬酸脱氢的正向反应，使NADP+还原，与镁标准一起在340nm测定吸光度的増加。 * 第四十张，课件共五十七张，编辑于2022年5月 酶活性恢复法应用举例 丙酮酸激酶法或色氨酸酶法测定钾离子 α-半乳糖苷酶法测定钠离子 淀粉酶法测定氯离子 超氧化物歧化酶法测定铜离子 碳