分子生物学第二次讨论课.ppt

Western blot 、蛋白质双向电泳的原理、方法及在医学中的应用 Western免疫印迹技术 准备工作 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 基本原理 蛋白质是两性电解质，在一定的pH条件下解离而带电荷。当溶液的pH大于蛋白质的等电点(pI)时，蛋白质本身带负电，在电场中将向正极移动；当溶液的pH小于蛋白质的等电点时，蛋白质带正电，在电场中将向负极移动 蛋白质在特定电场中移动的速度取决于其本身所带的净电荷的多少、蛋白质颗粒的大小和分子形状、电场强度等 主要原料 10%SDS 30%凝胶贮液（29%ACr-1%Bis） pH8.3Tris-Gly电极缓冲液 tris-HCl（PH6.8）缓冲液 溴酚蓝 等 制作堆积胶后上样 堆积胶凝固后，冲洗玻璃板及电泳槽加电泳缓冲液每个槽 加5ul样品 电泳 接好正负极开始电泳。30ma恒流电泳。 聚丙烯酰胺凝胶是由一定量的丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合而成的三维网状孔结构。 调整双丙烯酰胺用量的多少，可制成不同孔径的两层凝胶；这样，当含有不同分子量的蛋白质溶液通过这两层凝胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率 如果在聚丙烯酰胺凝胶中加入一定浓度的十二烷基硫酸钠(SDS)，由于SDS带有大量的负电荷，且这种阴离子表面活性剂能使蛋白质变性，特别是在强还原剂如巯基乙醇存在下，蛋白质分子内的二硫键被还原，肽链完全伸展，使蛋白质分子与SDS充分结合，形成带负电性