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转录因子互作研究方法 在生物体中，各种生命活动几乎都有蛋白质的参与，而且绝大多数的生命 活动都需要多种蛋白质参与，它们或者形成一个复合体，或者在不同的时间、不 同的位置参与到生命活动中。这样就不可避免的发生各种类型的蛋白质相互作用， 这些相互作用构成一个庞大的网络，支撑生命体的活动。特别是各类转录因子之 间的相互作用，在生物体内基因表达的调控及各类信号通路中起关键作用。 随着对转录因子以及转录因子相互作用研究的深入，研究蛋白质之间相互作用的技术越来越多。其中有可以大量检测蛋白质相互作用的技术，如酵母双杂交技术（Yeast Two-Hybrid）、蛋白质芯片（Protein Chip）；还有一些多用于已知蛋白相互作用验证的技术，包括：免疫共沉淀（ Co-immunoprecipitation，Co-IP）、 Pull-down 技术（Pull-down assay）、荧光共振能量转移技术（Fluorescence resonance energy transfer ， FRET ）、 分 子 荧 光 互 补 技 术 （ Bimolecular fluorescence complementation，BiFC）；还有一些新的技术层出不穷，如美国 Signosis 的转录因子互作微孔板芯片技术。 1、酵母双杂交技术 Fields 等人首先在 1989 年介绍了酵母双杂交技术，这是一种基于酵母转录激活因子 GAL4 特点建立起来的技术。在酵母双杂交实验过程中，将诱饵蛋白基因与 DBD 结构域基因融合，将需要筛选的全长 cDNA 构建成与 AD 结构域基因融合的文库。当诱饵蛋白与 cDNA 表达的蛋白质发生相互作用时，会将 DBD 结构域与 AD 结构拉近，启动下游报告基因的表达。 酵母双杂交技术有自身的优势：a、蛋白质之间的相互作用在细胞体内进行，在一定程度上反应了蛋白质相互作用的真实环境；b、利用酵母体内激活因子的特性，相对来说比较敏感。同时，酵母双杂交也存在一些缺陷：首先，诱饵蛋白与靶蛋白的相互作用发生在细胞核内，对于一些不能入核的蛋白质无法检测；第二，酵母中表达的蛋白质只能进行有限的翻译后修饰，对于一些需要多种翻译后修饰的蛋白质作用有限；第三，酵母双杂交实验中经常出现假阳性和假阴性的现象；第四，有一些诱饵蛋白对酵母具有毒性或者本身就能够激活报告基因的表达， 不适合使用酵母双杂交技术。 2、免疫共沉淀 免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation，Co-IP）是基于抗原-抗体专一性反应 的一种研究蛋白质相互作用的经典方法。这种方法在非变性条件下裂解完整细胞， 细胞中的大多数蛋白质都以其原本的状态存在于裂解液中，很多蛋白质复合体保 持聚合状态，使得很多蛋白质与蛋白质之间的相互作用都保留了下来。使用一种 已知蛋白质的抗体将其沉淀，那么与这种蛋白质相互作用的蛋白质也会一起沉淀 下来，进一步分析沉淀下来的蛋白复合物，可以得到与已知蛋白相互作用的蛋白 质的信息。该方法最大的特点是在蛋白质本身所处的细胞环境中检测蛋白质相互 作用，真实性较高，所以常被用于验证两种蛋白质的相互作用是否真实，也可用 于确定某种蛋白质在细胞内的伴侣蛋白。其缺点是常常产生非常显著的背景，而 且也不适用于高通量的实验研究。 3、 Pull-down 技术 Pull-down 技术（Pull-down assay）利用了标签与相应固相支持物之间的亲和作用。将已知蛋白与适当的标签融合表达，由于标签的存在，融合蛋白会吸附在固相支持物上，与已知蛋白相互作用的蛋白质会随之保留下来，其余蛋白则被洗 掉。Pull-down 技术既可以作为第一种方案确定相互作用对，同样也可以对于使用其它方法筛选得到的相互作用对进行确定。目前比较常用的标签包括 GST、6 ×His、MBP 等。Pull-down 技术的优点是操作简单、方便，花费少；但是这种体外鉴定蛋白质相互作用的方法更适合于鉴定相互作用比较稳定的蛋白对，无法检测微弱以及瞬间的蛋白质相互作用，而且较大的标签可能影响蛋白质的结构。 4、转录因子互作微孔板芯片技术 Signosis 的转录调控因子互作微孔板芯片技术可以同时分析一个转录 因子或调控因子与多个转录因子间的 相互作用。首先针对 96 种已知转录因子设计一系列独特的生物素标记探针， 每种探针分别可以与特定转录因子结 合，每个探针代表一种特定的转录因 子。将探针混合物、核提取产物（样 本）以及目的转录因子抗体混合孵育， 探针与相应的转录因子相结合；同时 目的转录因子、相应的抗体及与目的 转录因子相互作用的转录因子相互结 合；探针-转录因子复合物通过离心柱上的蛋白 G 或琼脂糖珠富集。洗去未结合的抗体探针和蛋白质，分离复合 物上结合的探针；生物素标记的探针 与预制