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Western 实验步骤 1。 电泳(Electrophoresis) (1) SDS凝胶配制 SDS—PAGE 凝胶进行配制,配方试剂去离子水， Arc—HCL (29:1)，10%APS,SDS，TEMED。 一般按分子大小配胶，现实验分离胶配 12％-15％的胶，浓缩胶 10％的胶。 配胶步骤： 1.清洗玻璃板，装好(注意不要漏即玻璃板要对齐)。 2.按比例配分离胶(8ml—10ml) 3。加水压胶，待分离胶凝固后(可见有分离胶与水有分隔线,一般凝固时间 30 分钟— 1 小时左右)， 吸走上层水面 4。按比例配浓缩胶(3ml-4ml)，加入分离胶上层，插入梳子, (注意别有气泡)，待凝. (如果今日不 上样可以放入 4°C 冰箱) 注意:玻璃板要洗得干净；玻璃板要装好,不要漏；制胶过程中，一定要充分混匀，而且避免有气泡； (2) 样品处理 1.准备无菌 EP 管，向 EP 管内加入样品蛋白质体积的 1/4 体积的 SDS 缓冲液(5X 的 SDS蛋白上 样缓冲液，现样品加 3。5ul)，之后加入相应蛋白样品(要制冰,蛋白质样品要放置在冰上)，充分吹打 混匀 2.100℃水浴加热 5 分钟,以充分变性蛋白。 3。12000r 离心 5 分钟。 (3) 上样与电泳 1.将玻璃板装入电泳槽中，加电泳缓冲液至泳槽的的 2/3 左右 2.蛋白质样品冷却到室温后 ,直接上样到 SDS—PAGE 胶加样孔内即可，样品两边加蛋白质 Maker (6ul)(注意上样蛋白质顺序,一定不要弄错)。 3。通常把电压设置在 100V,然后设定定时时间为 100 分钟(一般为 90-120 分钟)。设置定时可以避 免经常发生的电泳过头。 通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳 ,或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情 况,预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳. (为了避免电泳过头，最好是在电泳设定时间的提前 30 分钟观察电泳) 注意：上样时尽量避免样本被上漏出孔外；注意电泳时间的把握；最重要的是一定要记录上样顺序，必要 时记录在本子上. 3.转膜(Transfer) 1。物品准备,甲醇，转膜缓冲液，滤纸,转膜槽，玻璃皿 3 个，制冰. 2.取下胶板,用专门的板将玻璃板分离(务必不要将胶弄破，动作轻些，从下面和上面分离玻璃板) , 切适合大小的胶(不要切掉 MAKER) . 3.用专门的板将胶转入事先放有转膜缓冲液的皿中，记录胶的顺序，剪与胶同等大小的 滤纸和转膜纸PVDF 膜，PVDF 膜要放入甲醇中浸 15 秒(一般 1-2 分钟)，胶要切角做标记(不要切到 maker)， 一般一个切三个角，一个切一个角，记录顺序 4。铺膜,PVDF 膜铺在胶上，在 PVDF 膜上铺三层滤纸，然后胶的对侧面铺三层滤纸即可(滤纸要大于 等 PVDF 膜， PVDF 膜要大于等胶) ,赶尽气饱。 5。再将铺好的膜胶滤纸，转入转膜夹中,有 PVDF 膜这面放在正极侧(即无色透明夹这面) ,再将夹子 放入转膜槽里(电极不要放错，蛋白质带负电的) 6.转膜,槽放入冰中，槽内放冰槽， 设定转膜电流为 300—400mA，电压 120 伏，转膜时间为 40 分钟(30—60 分钟)。 注意： 实验选用 PVDF 膜但硝酸纤维素膜比较脆，在操作过程中特别是用镊子夹取， 膜不要碰到其他地方 特别是手不要碰到膜；动作要轻；赶尽气饱；正负极不要弄错；记录胶的顺序； 通常如果使用 Bio-Rad 的标准湿式转膜装置，可以设定转膜电流为 300-400mA，电压 120 伏，转膜时 间为 30—60 分钟。也可以在 15-20mA 转膜过夜。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定, 目的蛋白的 分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。 在转膜过程中， 特别是高电流快速转膜时， 通常会有非常严重的发热现象,最好把转膜槽放置在冰浴中 进行转膜。 转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准， 通常分子量最大的 1-2 条带较难全部转到膜上。 转膜的效果也可以用丽春红染色液对膜进行染色，以观察实际的转膜效果。也可以用考马斯亮蓝快速染色 液对完成转膜的 SDS胶进行染色，以观察蛋白的残留情况。 4．封闭 1。转膜完毕后，将蛋白膜放入,TBS 漂洗 1-2 分钟 2。再用 TBST 封闭,在摇床上摇 1 小时，装入薄膜内 配制 TBS：1MtriHCL (PH8。0) 10ML,1M NaCL 150ml，dd 水 840ml； TBST (MILLK)：5%millk (脱脂奶粉)， 0。1%tween20,TBS 注意:从转膜完毕后所有的步骤，一定要