PTEN基因转染对人膀胱癌细胞BIU87中PI3KAkt信号通路的影响（行业资料）.docVIP

PTEN基因转染对人膀胱癌细胞BIU87中PI3KAkt信号通路的影响（行业资料） 文档信息 ： 文档作为关于“行业资料”中“医学资料”的参考范文，为解决如何写好实用应用文、正确编写文案格式、内容素材摘取等相关工作提供支持。正文9345字，doc格式，可编辑。质优实惠，欢迎下载！ 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：PTEN基因转染对人膀胱癌细胞BIU87中PI3KAkt信号通路的影响 2 1 材料与方法 2 2 结 果 4 3 讨 论 4 文2：LKB1基因转染对人肺腺癌细胞生物学行为的影响 5 1 材料和方法 6 2 结果 8 3 讨论 11 参考文摘引言： 12 原创性声明（模板） 14 文章致谢（模板） 14 正文 PTEN基因转染对人膀胱癌细胞BIU87中PI3KAkt信号通路的影响（行业资料） 文1：PTEN基因转染对人膀胱癌细胞BIU87中PI3KAkt信号通路的影响 PTEN是迄今为止发现的第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因，它通过发挥磷酸酶作用，降低多种信号传导途径的关键酶的磷酸化水平，阻断信号传导通路，以抑制细胞的生长、黏附、铺展和迁移，诱导凋亡，从而对肿瘤的生长、侵袭和转移产生负性调节作用。PI3KAkt途径是蛋白激酶偶联受体介导的一条重要的信号转导通路，细胞外信号分子通过磷酸化依次激活三磷酸酰肌醇激酶(PI3K)、蛋白激酶B (Akt/PKB)及其他下游信号分子，以促进细胞的增殖，抑制凋亡并对细胞周期起正调控作用，导致细胞恶性转化。本实验检测PTEN基因转染前后膀胱癌细胞P110(PI3K的催化亚单位)、磷酸化P110、Akt和磷酸化Akt的表达情况，以期证明PTEN可能通过PI3KAkt信号传导途径起抑癌作用。 1 材料与方法 主要材料和试剂 人膀胱癌细胞系BIU87从武汉同济医院妇科肿瘤实验室引入，pBpPTEN及pBabepuro(pBp)空质粒由武汉同济医院骨科冯尔宥博士惠赠，DH5α大肠杆菌菌株来自武汉同济医学院生化教研室。Trizol和大量质粒抽提纯化试剂盒(上海华舜生物工程有限公司)、限制性内切酶EcoRⅠ(宝生物工程大连有限公司)、脂质体Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)、PCR引物(上海赛百盛公司)、通用RTPCR试剂盒(北京博大泰克生物基因技术有限公司) 细菌的转化和扩增培养 氯化钙法制备感受态大肠杆菌DH5α。于EP管中加入质粒和感受态DH5α，混匀后至水浴中热休克，再加入无抗生素LB培养基孵育。从EP管中取菌液，接种于含氨苄青霉素的LB琼脂平板上，培养过夜。挑取单个菌落，转入含氨苄青霉素的LB培养基中，振摇过夜至饱和生长，-70℃冰箱保存。 质粒的抽提纯化和酶切鉴定 取质粒转化的菌液到含氨苄青霉素的LB培养基中，振摇过夜。按大量质粒抽提纯化试剂盒说明书的步骤，提取并纯化pBpPTEN或pBp。将纯化的质粒DNA，于紫外分光光度计上检测纯度，A260/A280=符合要求。琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切DNA片段。 基因转染和细胞筛选 在6孔板中接种BIU87细胞，培养至满70%-80%，按脂质体Lipofectamine 2000说明书的步骤，将pBpPTEN或空质粒pBp导入BIU87细胞，转染24h后换液，并于荧光显微镜下观察，继续培养48h，加嘌呤霉素筛选并扩增培养。 RTPCR 提取细胞RNA后，按通用RTPCR试剂盒步骤进行操作。反应条件：94℃预变性5min，94℃变性50s，58℃退火50s，72℃延伸1min，循环32周，72℃再延伸8min。PTEN的上游引物为5′TTTGTGGTCTGCCAGCTA3′，下游引物为5′GGTTCATTCTCTGGATCAGA3′， 扩增片段为510bp。βactin作内参照，其上游引物为5′CCGACAGGATGCAGAAGGAGAT3′，下游引物为5′GTCAAGAAAGGGTGTAACGCAACT3′，扩增片段为238bp。将pBpPTEN转染细胞(pBpPTENBIU87)、pBp转染细胞(pBpBIU87)和未转染细胞(BIU87)的PCR产物分别经2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙啶染色，凝胶分析系统观察。 Western blot 制作凝胶(SDS聚丙烯酰胺凝胶)后，凝胶板安置于电泳槽，将处理好的样品加入槽内。电泳后取出凝胶，进行半干式电转移，胶中的蛋白质将转移至膜上。最后行免疫显色。膜置滤纸上干燥，分析结果。 2 结 果 质粒鉴定证实含有PTEN基因(图1)，RTPCR证实PTEN转染后稳定表达(图2)。三种细胞P110和A