实验蛋白质标准曲线的制作.ppt

关于实验蛋白质标准曲线的制作 第1页，共13页，2022年，5月20日，22点18分，星期三 一、实验目的 学习考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）法测定蛋白质浓度的原理和方法 第2页，共13页，2022年，5月20日，22点18分，星期三 二、实验原理 一般用分光光度法测物质的含量，先要制作标准曲线，然后根据标准曲线查出所测物质的含量。 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。 第3页，共13页，2022年，5月20日，22点18分，星期三 考马斯亮蓝G－250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。它和蛋白质通过范德华力结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律（Beer’s law）。此染料与蛋白质的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残结合，通过测定595nm吸光度可测定蛋白质的含量。另外，反应体系中呈现的颜色变化主要是G-250分子间疏水相互作用形成的聚集体聚集程度不同引起的。单体形式表现为蓝色，单体和聚集体共存时表现为绿色，全为聚集体形式呈现为棕红色。影响因素主要为溶液体系中磷酸、乙醇、NaCl的含量。 第4页，共13页，2022年，5月20日，22点18分，星期三 第5页，共13页，2022年，5月20日，22点18分，星期三 蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h，之后，蛋白质―染料复合物发生聚合并沉淀出来。 第6页，共13页，2022年，5月20日，22点18分，星期三 三、实验仪器和试剂 （一）试剂 1. 考马斯亮蓝试剂： 考马斯亮蓝G－250 100mg溶于50mL 95%乙醇，加入100mL 85% H3PO4，用蒸馏水稀释至1000mL,滤纸过滤。最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G—250,4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4。 2. 标准蛋白质溶液： 纯的牛血清血蛋白(BSA)，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度同0.15mol/L NaCl配制成1mg/mL蛋白溶液。 第7页，共13页，2022年，5月20日，22点18分，星期三 （二）器材 721型分光光度计、移液管（1mL，5mL）、试管及试管架 第8页，共13页，2022年，5月20日，22点18分，星期三 四、实验步骤 试管编号 0 1 2 3 4 5 1mg/mL标准蛋白（mL） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 0.15mol/L NaCl （mL） 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 考马斯亮蓝试剂 （mL） 5 5 5 5 5 5 充分摇匀，20min内以0号管为空白对照,在595nm测定 A595nm － 第9页，共13页，2022年，5月20日，22点18分，星期三 以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为200μg、400 μg、600μg、800 μg、1000 μg），在坐标轴上绘制标准曲线。 1. 利用标准曲线查出回归方程。 2. 用Excel作图，测出回归线性方程。即A595nm=a×X。相关系数一般大于0.9。 3. 未知样品蛋白质浓度的测定： 第10页，共13页，2022年，5月20日，22点18分，星期三