试剂盒原理PPT课件.pptVIP

.专业医学讨论. .护理诊疗 .专业医学讨论. .护理诊疗 .专业医学讨论. .护理诊疗 .专业医学讨论. .护理诊疗 .专业医学讨论. .护理诊疗 .专业医学讨论. .护理诊疗 谈原理，看ELISA究竟为何物讲方法，瞧试剂盒到底怎么使 * 第一部分 抗原抗体基本概念 一、概念 抗原（Antigen, Ag）是刺激机体产生免疫应（应是指抗原刺激机体产生免疫应答产物--抗体或免疫效应细胞）答（答是指相应抗原与免疫应答产物结合并将其排除体外）的物质。 抗原主要指病原微生物及其代谢产物以及抗毒素血清和药物等。根据来源可分为外来抗原和自身抗原。 * 二、抗原的两种基本特性 1. 免疫原性（immunogenecity），是指抗原分子能够刺激机体产生免疫应答（产生特异性抗体及免疫效应细胞）的性质。 Ag T B 致敏T细胞 浆细胞 抗体 免疫原性示意图 * 2. 抗原性（antigenicity），又称免疫反应性，是指抗原分子与免疫应答产物（抗体或免疫效应细胞）发生特异性结合的性质。 Ag T B 致敏T细胞 浆细胞 抗原性（免疫反应性）示意图 抗体 * 三、完全抗原与半抗原 1. 完全抗原（complete antigen)具有免疫原性和抗原性的物质。 2. 半抗原（incomplete antigen ）无免疫原性，只有抗原性的物质。 3. 载体（carrier）赋予半抗原以免疫原性的蛋白质。4. 半抗原 + 蛋白质（载体） ＝ 完全抗原。 5. 抗原决定簇（antigenic determinant）, 又称表位（epitope）。抗原分子存在的能与TCR/BCR或抗体Fab片段特异性结合的特殊化学基团，是免疫应答特异性的物质基础。 * 四、 抗体概论 1. 抗体（antibody, Ab） 是由抗原刺激而产生并能与刺激其产生的抗原发生特异性结合的、具有免疫功能的糖蛋白。抗体主要存在血清中，也存在于如呼吸道粘膜液、小肠粘膜液、唾液以及乳汁等其它体液中。 2. 免疫球蛋白（immunoglobulin, Ig） 具有抗体活性或化学结构与抗体分子相似的球蛋白。 * 五、单克隆抗体和多克隆抗体 1.多克隆抗体（polyclonal antibody） 抗原分子通常具有多个抗原决定簇，动物免疫后可刺激多种具有相应抗原受体的B细胞发生免疫应答，因而可产生多种针对不同抗原决定簇的抗体。这些由不同B细胞克隆产生的抗体称为多克隆抗体（polycolonal antibody, PcAb）。 * 2.单克隆抗体（monoclonal antibody, McAb） A.定义：由单一克隆B细胞杂交瘤产生的、只识别抗原 分子某一特定抗原决定簇的、具有高度特异性的抗体。 B.特点 具有高度均一性。 C.杂交瘤细胞 骨髓瘤细胞 — 无限增殖； 免疫B细胞 — 合成、分泌特异性抗体。 D.杂交瘤技术 HAT培养基：次黄嘌(H)、氨基蝶呤(A)和胸腺 嘧啶核苷(T)。 * 单克隆抗体制备流程 1.免疫动物 （使小鼠产生致敏B淋巴细胞） 2.细胞融合（加入PEG） 3.选择性培养（HAT选择性培养基） 4.杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化 （ELISA方法进行筛选，特异性，亲和力，效价及交叉反应的评价） 5.单克隆抗体的大量制备 （体内诱生：腹水） （体外培养：细胞培养液） * 单克隆抗体与多克隆抗体的比较 * 第二部分 ELISA试剂盒的组成及原理 ·操作流程 ·注意事项 * 1 间接竞争法测抗原 　 样本中的待测药物和固相化的抗原共同竞争一定量的抗体，加入酶标记抗抗体（酶标二抗）后能与固相化的抗原抗体复合物特异性结合，经底物显色后检测，样本中药物含量愈高，竞争结合的抗体量愈多，从而结合在固相上的酶标记抗抗体（酶标二抗）量愈少，最后的显色也愈浅。本公司及国内产品多用此法。具体操作步骤如下： 1）加入标准品/样本，再加入抗体，保温反应。样本中药物与固相抗原同时竞争与特异性抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去游离物质及吸附在固相载体上结合不紧密的物质。2）加酶标抗抗体，固相免疫复合物中的抗体与酶标抗体抗体结合，从而间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量与样本中受检药物的量负相关。3）加底物显色，固相上的酶催化底物成为有色产物。通过仪器检测分析，测知样本中抗原的量。 * 2 直接竞争法测抗原 （1）直接竞争酶标抗原法测抗原 样本中的待测药物和一定量的酶标抗原