固定化酶与固定化细胞.pptxVIP

会计学;5.1 固定化酶的发展历史; 20世纪60年末，日本田边制药公司开发利用固定化 酶(离子吸附结合的L-氨基酸酰化酶)拆分外消旋氨基酸 衍生物生产L-氨基酸获得成功。这是固定化酶的首次 工业化应用。;发展中后期（ 20世纪70年代～80年代）;◆ 极易将固定化酶与底物、产物分开；产物溶液中没有 酶的残留，简化了提纯工艺. ◆ 可以在较长时间内反复使用，有利于工艺的连续化、 管道化。 ◆ 酶反应过程可以严格控制，有利于工艺自动化和微 电脑化。 ◆ 在绝大多数情况???提高了酶的稳定性。 ◆ 较能适应于多酶反应。 ◆ 酶的使用效率提高，产物得率提高，产品质量有保障， 成本低。 ;◆ 酶固定化时酶的活力有所损失。同时也增加了固定化 的成本，使工厂开始投资大。 ◆ 比较适应水溶性底物和小分子底物。 ◆ 与完整细胞比较，不适于多酶反应，特别是需要辅因子 的反应，同时对胞内酶需经分离后．才能固定化。 ;◆ 省去了酶的分离手续．为多酶系统，无须辅因子再生。 ◆ 细胞生长快、而且多、反应快。 ◆ 可以连续发酵，节约了成本，而且在蒸馏和提取前不用 分离去细胞，能一边排出发酵液，一边进行培养，排除 了产物抑制和消耗。 ◆ 保持酶在细胞内的原始状况，增加了酶的稳定、特别是 对污染因子的抵抗力增加。 ;◆ 必须保持菌体的完整，防止菌体自溶，否则， 将影响产品纯度。 ◆ 必须防止细胞内蛋白酶对所需酶的分解，同时， 需抑制胞内其他酶的活性止副产物的形成。 ◆ 细胞膜、壁会阻碍底物渗透和扩散。 ;5.2 酶的固定化方法;5.2.1 吸附法;酶通过非共价键结合到载体上;1 非特异性物理吸附固定化酶;物理吸附载体的分类;2 离子吸附固定化酶;用于离子吸附的载体分类;4） DEAE-Sephadex固定化氨基酰化酶具体操作步骤： ; 酶的吸附与解吸还与介质中离子强度、pH、温度，载体的性质等有关。 pH的变化影响到载体和酶的电荷，从而影响载体对酶的吸附。在等电点两侧(±1-2pH单位)吸附将明显减少，但也有个别例外。 盐对吸附的影响较为复杂．在一些特殊事例中，盐可以促进蛋白质的吸附。这就是所谓的盐析吸附。 对蛋白质吸附来说，随温度的升高吸附下降。 载体的表面积、多孔性等都影响对酶的吸附。; 通过酶蛋白化学修饰来增加蛋白质分子上电荷，能有效的克服吸附法制备的固定化酶在使用过程的解吸。;3 疏水性吸附固定化酶;4 生物特异性吸附固定化酶;例：;生物特异性吸附酶的优点;5 亲和吸附固定化酶;;;5 亲和吸附固定化酶;利用螯合的变价金属离子亲和固定酶的优缺点;;第28页/共83页;包埋法的优缺点;包埋法常用凝胶包埋法和微囊化法。;例 ：聚丙烯酰胺凝胶包埋法。;通过预聚物交联形成凝胶包埋酶;;;;;微囊化包埋酶; 但由于它具有抗原性，容易诱发免疫反应，而且 它在人体内的清除速率快，半衰期短，因此希望将其 固定化或修饰以达到掩盖抗原决定簇、抑制免疫反应、 提高它在体内半衰期的目的。;微囊化的酶;微囊化酶的方法;例：;界面聚合形成微囊;5.2.3 共价结合固定化酶 ;; 从理论上讲，酶蛋白上可供载体结合的功能基团有以下几种： ①酶蛋白N—端的氨基或赖氨酸残基的-氨基 ②酶蛋白C-端的羧基以及Asp残基的α-羧基和Glu残基γ-羧基。 ③Cys残基的巯基。 ④Ser、Tyr、Thr残基的羟基。 ⑤Phe和Tyr残基的苯环。 ⑥His残基的咪唑基。 ⑦Trp残基的吲哚基。 在实际中偶联最普遍的基团是：氨基、羧基以及苯环。 被偶联的基团还应是酶活性的非必需基团，否则将导致酶 失去活性。 ; 载体直接关系到固定化酶的性质和形成。对载体的一般要求是: ◆一般亲水载体在蛋白质结合量和固定化酶活力及其稳定 性上都优于疏水载体。 ◆载体结构疏松，表面积大，有一定的机械强度。 ◆载体必须有在温和条件与酶共价结合的功能基团。 ◆载体没有或很少有非专一性吸附。 ◆载体来源容易。; 酶和载体的连接反应取决于载体上的功能基团 和酶分子上的非必需侧链基团，而且是在十分温和 的pH、中等离子强度和较低温的缓冲液中进行。 当载体上的官能团不能在室温等温和的条件下与 酶分子表面的官能团反应时，载体上的官能团必须事先活化 下面简单介绍一些活化官能团的方法;;例：;芳香烃化反应;缩合反应;;叠氮化反应;异氰