第五章实验中的样本制备.pptxVIP

;但由于传统的核酸提取方法常涉及去垢剂裂解、蛋白酶处理、有机溶剂提取及乙醇沉淀等步骤,不但繁琐,而且增加了环境因素对标本以及标本间相互污染的机会,不但在RNA检测时,易出现假阴性,而且当使用极为敏感的聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)及体外转录扩增系统检测时,易得到假阳性结果。;同时,由于这些方法要用到一些挥发性的有机溶剂,故对实验操作人员的身体健康有一定的影响。因此,简单而又高效且无需使用酚和氯仿的核酸提取方法对上述敏感的基因扩增检测技术的广泛应用有重要意义。;此外,标本的处理及保存对DNA和RNA(尤其是RNA)的影响较大,因此,在核酸测定时,样本的处理及保存,对保证测定的准确有效尤为重要。临床基因扩增检验中常涉及的标本有血清(浆)、全血、外周血单个核细胞、分泌物、拭子、脓、体液、石蜡切片、新鲜组织等,这些临床标本的处理和保存方法各有不同。;第一节 临床标本的处理和保存;在某些病原体如乙型肝炎病毒(hepatitis B virus ,HBV)、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)和人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)等的PCR临床测定中,标本的获取和保存,关于DNA测定,估计依照一般的血清标本处理程序,对测定影响不大,;但关于RNA测定,标本的获取和保存方式对测定结果,估计有决定性影响。有研究表明,用于RNA测定最好是使用EDTA抗凝(严禁使用肝素,因其对PCR扩增有抑制,且特别难在核酸提取过程中完全去除)全血标本,抗凝后6小时内分离血浆,如使用血清标本,则需尽快(2小时内)分离血清,标本的短期(1-2周)保存可在-20℃下,较长期保存应在-70℃。; 以全血作为待测标本时,必须注意抗凝剂的选择,一般使用EDTA-Na2 或枸橼酸钠,不可使用肝素。全血样本如用于DNA提取检测,可4℃下短期保存,如用于RNA检测,则应在取血后,尽快提取RNA; 外周血单个核细胞可从抗凝全血制备,主要有两条途径,一是使用淋巴细胞分离液分离制备;二是使用红细胞裂解液,裂解全血中的红细胞,经生理盐水数次洗涤,即可得到单个核细胞。外周血单个核细胞如暂不得取核酸,可保存于-70℃下。; 痰属于分泌物,临床上常用作为结核分枝杆菌DNA测定标本。由于痰标本中含有大量粘蛋白和杂质,故在核酸提取时,需对标本进行初步处理,即用1 mol/L NaOH液化。;需注意的是,液化时不能加热,液化时间不能过长,液化标本如不马上用于核酸提取,可保存于-70℃下。此外,如用于非结核分枝杆菌如肺炎支原体的PCR检测,痰标本只能室温悬浮于生理盐水中,充分振荡混匀,促使大块粘状物下沉,取上清离心,所得到的沉淀物即可用于核酸提取。; 在使用PCR方法检测性病病原体时,临床标本一般为棉拭子,可将棉拭子置于适量生理盐水中,充分震荡洗涤后,室温静置5-10分钟,待大块状物下沉后,取上清马上离心,其后的沉淀即可用于DNA提取,如不马上用于核酸提取,则需保存于-70℃下。; 脓液的处理依情况而定,如用于分枝杆菌(如结核分枝杆菌)核酸测定的标本,粘稠的脓液可采纳痰标本的处理模式,先进行液化,再离心取沉淀提取DNA;水样的脓液则直截了当离心,沉淀用生理盐水洗2-3次后,即可用于DNA提取。;关于用于非分枝杆菌测定的脓液标本,如过于粘稠,则加入适量生理盐水,充分振荡后,静置,取上清马上离心,沉淀用于DNA提取;如为水样,则按上述直截了当离心取沉淀即可。沉淀标本的保存条件同样为-70℃。; 临床体液标本包括胸水,腹水,脑脊液,尿液等,可按水样标本的方式离心取沉淀后,提取核酸。沉淀样本的保存同上。; 组织有新鲜组织块和石蜡切片。新鲜组织块的处理步骤首先用生理盐水洗两次,然后将其捣碎或切碎,加入生理盐水后剧烈震荡混匀,离心,弃上清,再用蛋白酶K消化后提取核酸。;新鲜组织最好是保存于50%乙醇中,具体作法是,先用生理盐水将组织洗一次,切成宽度小于1cm的小片,加入适量的生理盐水,然后,边摇边加入无水乙醇至终浓度为50%,如此固定的组织标本室温下可保存数日,4℃可保存6年。; 石蜡切片用于核酸提取,需先用辛烷或二甲苯脱蜡,再用蛋白酶K消化后即可进行DNA提取。总而言之,标本的收集及适当的预处理,对用于PCR测定的核酸模板的成功提取,具有决定性作用。在这个地方要着重强调的一点是,所有用于上述临床标本收集的容器如试管或离心管,均应使用前高压灭菌。;其它标本;第二节 核酸的提取方法一、DNA提取的经典方法 DNA提取的经典方法,即所谓的“酚-氯仿提取法”。这种方法提取的DNA纯度高,效果好,缺点是较为繁琐。方法如下:;1、试剂(1)蛋白酶