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食品检验技术之蛋白质和氨基酸的测定 （一）测定方法概述1、测定蛋白质含量的方法： 凯氏定氮法快速测定法（双缩版、紫外、水杨酸比色、染料结合法） 2、测定氨基酸的方法： 甲醛、电位滴定、苗三酮比色气相、液相、薄层、离子交换色谱 自动分析仪 （二）凯氏定氮法1、实验原理 以硫酸铜为催化剂，用浓硫酸消化试样，使有机氮分解为氨，与硫酸生 成硫酸镂。然后加碱蒸储使氨逸出，用硼酸溶液吸收，再用盐酸标准溶 液滴定。根据盐酸标准滴定溶液的消耗量计算蛋白质的含量。 2、实验步骤 （1）试样的制备与称样（称0.5-5g试样（含氮30-40mg）放入凯氏烧 瓶中）。 （2）消化向凯氏烧瓶中依次加入硫酸铜0.4g、硫酸钾10g、硫酸20mL。将凯氏 烧瓶放在电炉上，缓慢加热。待起泡停止，内容物均匀后，升高温度， 保持液面微沸。当溶液呈蓝绿色透明时，继续加热0.5-lh。取下凯氏烧 瓶冷却至约4（TC,缓慢加人适量水，摇匀，冷却至室温。 （3）蒸播与吸收将消化好并冷却至室温的消化溶液全部转移到100mL容量瓶中，用蒸 偏水定容至刻度，摇匀。 向接收瓶内加入30mL2%硼酸溶液和1滴混合指示剂。将接收瓶置于蒸 储装置的冷凝管下口，使下口浸入硼酸溶液中。取10±0.05mL稀释定 容后的试液，沿小玻璃杯移入反响室。并用少量水冲洗小玻璃杯，一并 移入反响室。塞紧棒状玻璃塞，向小玻璃杯内加入约10mL40%氢氧化 钠溶液。提起玻璃塞，使氢氧化钠溶液缓慢流入反响室。立即塞紧玻璃 塞，并在小玻璃杯中加水，使之密封。通入蒸汽，蒸储5min0降低接 收瓶的位置，使冷凝管管口离开液面，继续蒸播Imin。用少量蒸储水 冲洗冷凝管管口，洗液并入接收瓶内。取下接收瓶。 （4）滴定用0.lmol/L盐酸标准滴定溶液滴定收集液至刚刚出现紫红色为终点。 同一试样做两次平行实验，同时做空白实验。 3、结果计算 （VO/V） X0.014XCx（%）=XFX100 mx（10/100）;（三）快速测定法 为满足生产过程的快速控制分析，减少环境污染、简便操作省时，建立 了快速测定方法；如：双缩眼法、紫外分光光度法、水杨酸比色法、染料结合法。 1、双缩眼法 （1）原理：双缩版在碱性条件下，能与硫酸铜结合生成红紫色络合 物。蛋白质中含有肽键，与双缩胭结构相似，也呈此反响。在一定条件 下其颜色深浅与蛋白质含量成正比；入max=560nm可用吸收光度法进行 比色测定。 （2）测定①标准曲线绘制 以采用凯氏定氮法测出蛋白质含量的样品作为标准蛋白质样，按蛋白质 含量40、50、60、70、80、90、100、110mg称取样品8份于纳氏比色 管中，各加入lmlCC14 （阻滞淀粉、还原糖、色素、类脂物溶解，，消 除干扰）加入双缩月尿试剂（酒石酸钾钠，KOH, CuSO4） 50.00ml振摇 均匀（lOmin）静置lh,取上层清液离心5min,再测Xmax=560nm时 的A （水作参比）。 ②样品测定准确称取适量样品，同样方法测样品的A。 （3）计算蛋白质（%） =（X/W）xlOO x——从标准曲线中查得蛋白质含量，mgw——测定样液相当样品质量，mg （4）说明①高脂肪样品，先用酸抽出弃之。 ②假设有不溶物可抽出蛋白质后再测。 2、水杨酸比色法 （1）原理:样品中蛋白质经硫酸消化后转变为镂盐，与水杨酸钠作用生 成蓝色化合物，在入max=660nm处比色测定，求出含氮量，计算蛋白质 %□ （2）测定:①标准曲线吸取含氮2.5|ig/ml的硫酸锻（NH4）2s04标准溶 液0、1.0. 2.0、3.0、4.0、5.0ml置于25ml容量瓶中,分别加入：空白酸 溶液2ml、磷酸盐缓冲液5m1、加水至15m1、水杨酸钠5m1、36?37℃恒 温水浴15min,加入次氯酸钠2.5ml,再在36?37T恒温15min,加水至刻 度入max=660nm测A。②样品处理：称取0.2?1.0g置于凯氏烧瓶中，加 入15ml浓H2so4, 0.5gCuSO4, 4.5g无水硫酸钠,小火加热沸腾后,进 行消化，待溶液澄清，呈暗绿色时，冷却，移至250ml容量瓶中，定容。 ③样品测定：吸取样液5m1 （必要时稀释）以下步骤同上“标准曲线”操 作。 （3）计算蛋（%）=总氮（%） xF （6.25） X--含氮量|ig, k--样品稀释倍数，m--样品质量，go（4）说明：①消化样品，当天测定，重现性好。②严格控制反响温度 （36?37。0 ,因为影响显色。 （四）氨基酸总量测定1、双指示剂甲醛滴定法（测定游离氨基酸） 有单指示剂滴定法、双指示剂滴定法。 单指示剂有：百里酚猷，酚猷。双指示剂有：中性红一百里酚配。 其原理均是用甲醛与NH2作用，使碱性消失，再用强碱滴定COOH。 测定：①样品（溶液）（20—30mg氨基