基因的分离与鉴定 (2)PPT课件.pptxVIP

基因的分离与鉴定 (2); DNA克隆片段的产生和分离 重组体DNA分子的构建及导入受 体细胞 基因克隆的实验方案 克隆基因的分离 重组子的选择与鉴定;克隆的概念;一、目的基因的分离 1.从生物基因组分离目的基因 利用基因文库筛选目的基因 基因组文库 、cDNA文库 利用mRNA或cDNA钓取目的基因;2. 利用基因表达产物来获取目的基因 使用探针从cDNA文库中筛选目的基因 3.用酶学或化学方法合成目的基因 逆转录酶法合成目的基因 PCR法合成目的基因 化学合成目的基因 胰岛素基因、干扰素基因等市场化;二、目的基因的来源 1. 基因组DNA的非特异性断裂 2. 染色体DNA的限制性内切酶酶解 3. 通过mRNA合成cDNA 4. 人工体外合成DNA片段 5. PCR扩增特异性基因片段; ;重组DNA分子的构建;构建重组DNA分子的途径;; 重组子分子导入受体细胞的途径 转化(transformation) 转染(transfection) 转导（transduction） ;转化（transformation）： 将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。 进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。转化过程所用的受体细胞一般是限制－修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。;转化的方法： 化学的方法(热击法)；使用化学试剂（如CaCl2）制备的感受态细胞，通过热击处理将载体DNA分子导入受体细胞； 电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。; 感受态细胞(Competent cells): 受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) ;转化的原理与技术： Ca2+诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌等），1970年建立此技术，其原理是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态;Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化 100ml菌体??养至OD600= 0.5，离心收集菌体 用10 ml冰冷的10 mM CaCl2溶液悬浮菌体，离心 用1 ml 冰冷的75 mM CaCl2溶液悬浮菌体 冰浴放置12 - 24小时，备用 ; 取100 μl 感受态细胞，加入相当于50 ng 载体的重组DNA连接液，混匀 冰浴放置半小时 在42℃保温2 分钟（热脉冲） 快速将转化细胞转移至冰浴中放置1- 2分钟 加入1ml新鲜培养基，于37℃培养1 小时（扩增） 涂在合适的固体培养基平板上进行筛选; 革兰氏阳性细菌（如枯草杆菌、链霉菌等）接纳外源DNA的主要屏障是细胞壁，因而这类细菌通常采用原生质体（细胞去壁后的形态）转化的方法转移质粒或重组DNA分子 酵母菌、霉菌、植物细胞也可用原生质体法进行转化;不同细菌的原生质体制备方法不尽相同，以链霉菌为例： 细菌需生长在高渗培养基中（如34%的蔗糖溶液，并加入甘氨酸以增加细菌细胞壁对溶菌酶的敏感性。在制备过程中，菌体应始终悬浮在10.3%的蔗糖等渗溶液中。与原生质体接触的所有器皿应保持无水无去污剂; 取0.2 - 1ml的原生质体悬浮液（108-109个原生质体），加入10 - 20 μl DNA重组连接液，同时加入含有PEG1000和Ca2+的等渗溶液，混匀 细菌原生质体的再生： 原生质体再生的主要目的是使细菌重新长出细胞壁。在特殊的固体培养基上进行，内含脯氨酸和微量元素 ;E.coli的电穿孔转化 在高压电场下使细胞产生瞬间的穿孔，这个穿孔足够大并可维持足够的时间，使外源DNA进入受体细胞。电穿孔法的转化效率比钙转化法高2~3个数量级。这种方法也可用于真核生物的转染 ; 将待转化的质粒或DNA重组连接液加在电穿孔转化仪的样品池中，两极施加高压电场。在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内 电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结构的受体细胞均有效，但转化效率差别很大 同样的原理，电穿孔法也可用于质粒消除实验 ;转染 是指转化感染（Transfection来自于transfomation与infection） 凡是以噬菌体（如M13）或病毒为载体，以转化的方法将DNA导入细胞的方法均称为转染。因此转染就方法来