基因工程载体.ppt

2.M13载体的构建 第三十一页，共三十六页。 五、噬菌体展示载体 其基本原理是将外源DNA片段插入噬菌体编码蛋白基因PⅢ中，使外源DNA片段对应的表达产物融合在噬菌体的外壳蛋白中形成融合蛋白，呈现在噬菌体表面。 第三十二页，共三十六页。 第三十三页，共三十六页。 第三十四页，共三十六页。 质粒 λ噬菌体 柯斯质粒 单链噬菌体 克隆DNA大片段 ±* + + - 构建基因组文库 - + + - 构建DNA文库 + - - - 常规的亚克隆化 + - - - 构建新型的DNA结构 + - - - 序列分析 + - - + 单链探针 - - - + 外源基因在大肠杆菌中的表达 + - - - * 外源DNA如超过10kb，则重组质粒的转化率和DNA得率都非常低　　　　　　　　　 四种常用载体的比较 第三十五页，共三十六页。 内容总结 质粒载体。1.pBR322是基因工程中最重要的一个人工质粒,有万能质粒之美称.。美国加利福尼亚大学的科学家J. Messing和J. Vieria于1987年首先构建。整合型、复制型、附加型和稳定型等类型。③具有合适的供外源基因插入的限制酶切割位点。Gal1-10 yeast promoter。ampicillin resistance gene。yeast centromeric sequence。（a）具有互补单链末端（粘性末端）的λ DNA分子。λ噬菌体的75-105%，只能接纳49kb×5%=2.45kb的DNA。⑴ 切去非必须区段，在切去的同时，加载目的基因（15-23Kb）。转录复制蛋白质合成 第三十六页，共三十六页。 * * * * * * * * * * * * 质粒载体 载体 噬菌体载体 动物病毒载体 大肠杆菌质粒载体pBR322 单链DNA M13载体 SV40载体 乳头瘤病毒载体 昆虫杆状病毒载体 柯斯(COS)载体 λ噬菌体载体 枯草杆菌质粒载体pNC3 酵母菌质粒载体2μ 农杆菌Ti质粒载体Ti 一 基因工程的基本元件 ------载体 第一页，共三十六页。 四、E.coli质粒载体 1.pBR322是基因工程中最重要的一个人工质粒,有万能质粒之美称. ①pBR322的构建 复制子:松弛型 选择标记:Amp、Tet 筛选形式:抗性插入失活 单一切点:24个 ③物理图谱 ②pBR322的特性 第二页，共三十六页。 pBR322 plasmid F. Bolivar R. L. Rodriguez Bacterial Resistance pBR322酶切图谱 第三页，共三十六页。 2.pUC系统 美国加利福尼亚大学的科学家J. Messing和J. Vieria于1987年首先构建 来自pBR322质粒的复制起点 氨苄青霉素的抗性基因 大肠杆菌β-半乳糖酶基因的启动子及其编码的α-肽链基因（lacZ’） 位于lacZ’基因内的一段MCS区段 第四页，共三十六页。 第五页，共三十六页。 第六页，共三十六页。 2.pUC系统 X-gal 溴氯吲哚+ β-半乳糖苷 -----蓝白斑筛选 插入片段 无酶活性 白斑 未插入片段 有酶活性 蓝斑 β-半乳糖苷酶 第七页，共三十六页。 3. TA载体 经 Taq DNA 聚合酶扩增后的 PCR 产物末端都带有单个 A 第八页，共三十六页。 酵母菌质粒载体 食品级微生物 适合于真核基因表达 基因产物外分泌 第九页，共三十六页。 七、酵母菌质粒载体 多数酵母中含有一种能独立复制的环状双链DNA，称为2μ质粒，长约6.3kb，有单一的复制起始点和一个自主复制功能区域（ARS片段）。 整合型、复制型、附加型和稳定型等类型。 ①含有E.coli质粒的复制起始序列。 ②含有酵母的筛选标记（如LEU2） ③具有合适的供外源基因插入的限制酶切割位点。 2.酵母菌质粒载体的特点 1.酵母菌质粒载体的类型 第十页，共三十六页。 Type Name Description bacterial origin ColE1 ColE1 (pUC-type) origin of replication promoter Gal1-10 promoter Gal1-10 yeast promoter selectable marker ampR ampicillin resistance gene selectable marker chlR chloramphenicol resistance gene LOST in recombined (with insert) form selectable marker URA3 URA