牛乳中A2型β-酪蛋白（A2奶）检测技术规程.pdfVIP

DB ××/T ××××—×××× 牛乳中A2型β-酪蛋白（A2奶）检测技术规程 1范围 本标准规定了的牛奶和奶粉中 A2 型 β-酪蛋白（A2 奶）的检测方法。 本标准适用于牛奶和奶粉中 A2 型 β-酪蛋白（A2 奶）的检测。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法 GB/T 19495.2 转基因产品检测 实验室技术要求 GB/Z 35959 液相色谱-质谱联用分析方法通则 3 术语与定义 下列术语和定义适用于本规程。 3.1 A2型β-酪蛋白 (A2 β-casein；A2 CSN2) β-酪蛋白由 224 个氨基酸（含有 15 个氨基酸的信号肽）组成，具有不同的变体型（A1 、A2 、A3 、 B 、C、E 、F、H1 、I ），当第51 位、52 位、82 位、103 位、108 位、121 位、137 位、167 位氨基酸分 别为谷氨酸、谷氨酸、脯氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、组氨酸、丝氨酸、脯氨酸时，称为 A2 型 β-酪蛋白。 3.2 A2奶（A2 milk） 所含 β-酪蛋白为 A2 型的牛奶称为 A2 奶。 3.3 质谱法（Mass spectrometry; MS） 试样被电离后，形成不同质荷比的离子，根据这些离子的质量数和相对丰度分析试样的方法。 3.4 质荷比 （Mass-to-charge ratio） 离子的质量 m 与其所带的电荷数 z 之比，以 m/z 表示。 4 检测原理 β-酪蛋白变体型对应不同的氨基酸突变位点（p.51 EK 、p.52 EK 、p.82 PH 、p.103 LI 、p.108 ML 、 p.121 HQ 、p.137 SR 、p.167 PL ）（参考序列：GenBank AAA30431.1 ），而不同氨基酸之间存在分 子量差异。利用质谱分析技术，根据质荷比差异将样品蛋白质中存在氨基酸突变的肽段鉴定出来，从而 确定氨基酸突变位点，实现对不同突变体型 β-酪蛋白检测的目的。 5 主要试剂配制 2 DB ××/T ××××—×××× 5 实验所用水为符合 GB/T 6682 规定的双蒸水；高压灭菌条件为 121℃，1.034*10 Pa 压力，蒸汽灭 菌 20min 。试剂配制见附录A 。 6 主要仪器设备 见附录 B 。 7 质谱检测及数据处理参数 见附录 C 8 检测方法 8.1 样本采集 8.1.1 待检测的新鲜牛奶 每头奶牛采集新鲜牛奶（排除头奶或末乳）50 mL，充分混匀后，-80 ℃保存。 8.1.2 待检测的商品化奶粉 包装未开封，常温储存。 8.2 蛋白提取 8.2.1 从-80 ℃取出牛奶样本，常温解冻后充分混匀，取样 50 μL，或称取奶粉样本30 mg 。 8.2.2 向上述样品中加入500 μL 裂解液【8 M 尿素，30 mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES ）】。冰上裂 解 10 min。离心，4 ℃ ，20 000g ，30 min 。取上清，避免吸到油脂。 8.2.3 加入二硫苏糖醇（DTT ）至终浓度 10 mM。56 ℃水浴 1 h。取出后，迅速加入碘乙酰胺（IAM ） 至终浓度 55 mM，暗室静置 1 h。 8.2.4 使用考马斯蓝染色法（bradford 法）对蛋白质进行定量。 8.2.5 对定量后的蛋白质进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）鉴定（如附录C.1 ）。 8.3 蛋白质的消化 8.3.1 每个样品取 2