系统生物学课件实验三+秀丽隐杆线虫的培养及其发育过程的观察.doc

高级生化与分子生物学实验 实验三秀丽隐杆线虫的培养及其发育过程的观察 PAGE 8 实验三 秀丽隐杆线虫的培养及其发育过程的观察 实验目的 理解线虫作为模式生物的优势以及在相关研究领域的应用； 掌握线虫的基本培养技术，观察并且区分两种线虫个体发育过程的异同； 理解线虫RNA干扰技术的基本原理，并学会使用该方法对目的基因进行干扰。 实验原理 秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegan）属于线虫动物门（Nematoda）隐杆线虫属（Caenorhabditis）秀丽隐杆线虫种（C.elegans），根据命名法则中的二名法命名为Caenorhabditis elegans。上世纪六七十年代分子遗传学的奠基人之一Sydney Brenner将线虫作为分子生物学和发育生物学研究的模式生物。 C.elegans为蠕虫状，长度约1mm，因其个体结构简单、体细胞数目恒定，特定细胞位置固定，生活史短、遗传背景清楚、基因组测序已经完成等，在遗传与发育生物学、行为与神经生物学、衰老与寿命、人类遗传性疾病、病原体与生物机体的相互作用、药物筛选、动物的应急反应、环境生物学和信号传导等领域得到广泛应用。如细胞凋亡现象及其机理以及RNA干扰技术最早都是在线虫中被揭示的。 （一）C.elegans的基本结构以及生活史 C.elegans有雌雄同体（XX）和雄虫(XO)两种性别，在自然条件下， 成虫大多为雌雄同体，雄虫的个体数只占大约千分之一。其基本的结构包括口、咽、肠、性腺以及胶原蛋白角质层，雌雄同体有两个卵巢、输卵管、储精囊，及单一一个子宫（图1，2），雄性有个单叶的性腺、输精管及一个特化为交配用的尾部（图3，4）。 C.elegans是唯一一个身体中的所有细胞能被逐个盘点并各归其类的生物。其幼虫含有556个体细胞和2个原始生殖细胞，而它的成虫则根据性别不同具有不同的细胞数。最常见的雌雄同体成虫在发育期间，共产生1090个细胞，其中131个在特定时期凋亡，因此，其成熟后含有959个体细胞和2000个生殖细胞，而较少见的雄性成虫则只有1031个体细胞和1000个生殖细胞。 C. elegans有五对常染色体和一对性染色体，是一个染色体数很少的二倍体。 图1 雌雄同体线虫解剖示意图 图2 雌雄同体线虫 A．DIC（微分干涉显微镜）拍摄的图； B. 雌雄同体线虫解剖示意图 图3 雄虫 A. 雄虫解剖示意图； B. DIC（微分干涉显微镜）拍摄的图； C. 性腺放大图； D. 成虫尾巴放大图； E. L3 L4时期雄虫尾巴图（上面是L4，下面是L3） 图4：电镜下的雄虫 图5 雄虫和雌雄同体线虫交配 C.elegans的生活史包括胚胎期、幼虫期（L1-L4）、成虫期三个阶段（如图6）。一个雌雄同体线虫一生约可以产300个卵，卵经过L1、L2、L3、L4 4个幼虫时期，进入成虫期，如果外部条件比较恶劣，比如：拥挤、缺乏食物等，线虫会进入一个特殊的L3时期——dauer时期来抵抗外部的不良环境。C.elegans在实验室20-22℃的条件下，约3.5天长成成虫，可存活两到三周。线虫可以自体受精，当卵母细胞经过贮精囊时受精，也可以接受雄虫的精子进行异体受精（图5）。 图6 22℃下秀丽隐杆线虫的生命周期 （二）线虫RNAi技术： RNAi （RNA-mediated interference）技术是指与靶基因同源的双链RNA诱导的特异转录后基因沉默现象。其作用机制是双链RNA被特异的核酸酶降解，产生干扰小RNA(siRNA)，这些siRNA与同源的靶RNA互补结合，特异性酶降解靶RNA，从而抑制、下调基因表达（图7）。RNAi技术已经发展成为基因治疗、基因结构功能研究的快速而有效的方法。 图7 RNAi原理示意图 1、长的双链RNA（Long double-stranded RNAs， dsRNAs; typically 200 nt）被引入细胞； 2、宿主细胞对这些dsRNAs产生反应，核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA（大约21～23 bp），即siRNA； 3、siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，反义siRNA再与体内一些酶(包括内切酶、外切酶、解旋酶等)结合形成RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)； 4、RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合部位的两端切割mRNA，使目标mRNA降解； 1998年，Fire建立了线虫RNA干扰技术，由于线虫R