转基因水稻多重ＰＣＲ和Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲ定性检测中的问题与策略（农学毕业论文资料）.docVIP

转基因水稻多重ＰＣＲ和Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲ定性检测中的问题与策略（农学毕业论文资料） 文档信息 ： 文档作为关于“研究报告”中“农林牧渔”的参考范文，为解决如何写好实用应用文、正确编写文案格式、内容素材摘取等相关工作提供支持。正文11381字，doc格式，可编辑。质优实惠，欢迎下载！ 正文 转基因水稻多重ＰＣＲ和Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲ定性检测中的问题与策略（农学毕业论文资料） 文1：转基因水稻多重ＰＣＲ和Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲ定性检测中的问题与策略 DOI:/-.002 转基因技术应用于作物以来，转基因产品如玉米、大豆、棉花等都已有商业化的品种问世；目前在世界上使用最多的转基因商业化基因是抗除草剂基因和Ｂｔ杀虫基因。而水稻作为一种主粮，商业化步伐远远慢于这几种作物；目前最有可能商业化的转Ｂｔ杀虫基因的是中国与国际水稻所合作研制的“华恢１号”、“Ｂｔ汕优６３”和欧洲研制的富含维生素Ａ的Ｇｏｌｄｅｎ ｒｉｃｅ［１，２］ 自从国家给转基因水稻发放了安全证书，转基因水稻的商业化成为了热门的议题。目前农业部发放安全证书的转基因水稻有抗虫转基因水稻“华恢１号”和“Ｂｔ汕优６３”，国家制定了关于作物和转基因水稻的检测方法标准［１，３］。国家质量检测部门有完善的种子和食品检测系统，来定性检测是否含有转基因成分。但是随着转基因水稻即将大规模的种植，科研人员在研究和育种过程也有大量的样品需要检测，主要目的有以下几个：①更好地进行常规品种转基因育种工作，防止转基因的品种污染常规品种，保持种质的纯合，同时检测转基因的水稻在田间有没有发生漂移；②节省人力物力，大量的水稻样品送到专门的质检部门检测价格昂贵；③有些检测样品中的转基因成分元件，是超出国家质量标准检测范围的。 转基因作物和转基因食品的检测方法有很多，例如ＰＣＲ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Bｌｏｔ、基因芯片等［４－７］。常规和便捷的方法是普通ＰＣＲ以及由其衍生出的半定量ＰＣＲ方法［８，９］；在国内外使用的最多定性作用更强的是Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ［１０－１２］。多重ＰＣＲ检测方法被广泛使用［４］。本文根据自己的一些实践，总结出了在食品检验、科研或者育种工作中进行多重ＰＣＲ检测分析转基因样品中的几个要点。 １ 污染源的杜绝 转基因检测中，只有杜绝一切污染源，才有可能在后续的检测中做出正确的判断。如果没有做好防止污染，很容易出现假阴性和假阳性。因此所有的试剂须新鲜现配、灭菌，枪头、离心管等要严格灭菌，玻璃器皿需要清洗干净［１３］。样品必须防止交叉污染，条件允许的话，可以进口高质量的离心管、枪头等，以便在后续的试验中起到排除污染的作用［１2］ ２ 样品ＤＮＡ的提取方法 ＤＮＡ的提取方法既可以采用经典的ＣＴＡＢ方法，也可以按照农业部的质检标准书的方法，这两种方法用于ＰＣＲ和半定量ＰＣＲ、Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ荧光定量ＰＣＲ都有很好的结果［３，１４］；条件允许的话，也可以采用试剂盒。有学者采用快速提取法获得的转基因番茄ＤＮＡ，用于Rｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ检测，取得了很好的结果；鉴于这一点，快速方法提取的转基因水稻ＤＮＡ，也应该可以适用于Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ的检测，这就为检测大量的水稻ＤＮＡ样品提供了便捷的途径［3，15－17］。Cankar等［18］、Demeke等［19］在水稻转基因检测的实践中，采取适用于ＲＦＬＰ分子标记检测的水稻ＤＮＡ快速提取法，取得了比较好的效果。 ３ 转基因水稻的多重ＰＣＲ检测 根据农业部的质检标准书，采用的是多重ＰＣＲ和Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ的方法。在转基因的检测中，有4个检测元件：启动子、终止子、靶基因、内参基因。转基因的定性检测中，首先要检测的是内参基因，因为内参基因能确定ＤＮＡ模板的质量；然后是检测启动子和终止子，在检测出启动子或者终止子以后，还要进一步检测靶基因。只有两个以上的转基因元件被检测出，才能定性为转基因的水稻［３，４，９，２０］ ３．１ 内参基因的检测 在定性检测转基因水稻中，会设置内参基因，农业部的质检标准书采用的是水稻ｓｐｓ（蔗糖磷酸合成酶）基因［３，２1］；也可以采用常规试验中经常用的水稻β－Ａｃｔｉｎ基因的引物（在不同的物种中高度保守，组织和细胞中的表达相对恒定内参基因的检测），可以对模板进行定性为水稻的ＤＮＡ，同时可以根据ＰＣＲ产物条带的亮度来确定模板的质量。 ３．２ 启动子的检测 ３．２．１ ＣａＭＶ ３５Ｓ启动子的检测 根据农业部制定的质检标准书，在目前的转基因水稻中的定性检测一般检查的是花椰菜病毒３５Ｓ启动子。早期的水稻转基因多采用这个启动子，这次农业部批准的“Ｂｔ汕优６３”也是采用的ＣａＭＶ ３５Ｓ启动子。 ３．２．２ 含ＣａＭＶ ３５Ｓ启动子的转基因水稻和病毒感染的定性区分 转基因食品中ＣａＭＶ ３５Ｓ启动子中有一个关键性问题就