【生物化学实验】血清γ球蛋白分离纯化与鉴定.pptVIP

蛋白质的电离示意图 * . DEAE－纤维素离子交换层析纯化γ－球蛋白 血清α、β、γ－球蛋白、清蛋白的等电点为： 清蛋白pI=4.64， α2球蛋白 pI=5.06， β球蛋白pI=5.12， γ球蛋白pI=7.3 本实验采用0.02 mol/l pH6.5 NH4Ac缓冲液进行洗脱。在此pH条件下，DEAE带正电荷，可与带负电荷的α、β-球蛋白和清蛋白结合，而带正电荷的γ-球蛋白不与DEAE结合，首先从层析柱中洗脱出来，首先收集到的既是纯化的γ-球蛋白。 * . 操 作 将脱盐后的球蛋白加于DEAE柱上（方法同凝胶过滤），用0.02 mol/l pH 6.5 NH4Ac缓冲液洗脱，流速10滴～15滴/分，用小试管连续收集流出液（约1.5 ml/管），用紫外分光光度计在λ280 nm下测其吸光度值，收集含量最高的部分，浓缩作纯度鉴定。用该缓冲液洗脱下来的是γ－球蛋白。 * . 四、γ－球蛋白纯化液的浓缩 利用葡聚糖凝胶富含羟基，吸水，不允许大分子蛋白进入微孔的特性，在样品溶液中加少量凝胶，离心，浓缩蛋白。 每ml纯化γ－球蛋白溶液加SephadexG25 0.25 g，摇动2～3分钟，室温静止2小时离心，上清即为浓缩γ-球蛋白（或用冷冻干燥仪使其浓缩）。 * . 五、γ－球蛋白鉴定 用醋酸纤维素薄膜电泳的方法，以血清电泳图谱为对照，鉴定所分离的蛋白质种类和纯度（参见血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳）。 * . 血清蛋白质乙酸纤维素薄膜电泳 * . 目的要求 掌握醋酸纤维薄膜电泳的原理； 学习电泳技术。 * . 原理 以醋酸纤维薄膜作为支持体的一种电泳方法。 在pH8.6巴比妥缓冲液中，血清蛋白质在电场中均带负电荷，向正极移动。 带电荷多、分子量相对小的泳动速度快；带电荷少、分子量相对大的泳动速度慢。 ? ? * . . 生物化学综合实验血清γ球蛋白的分离纯化与鉴定 生物化学实验 CQMU * . 实验目的 从人血清中分离纯化γ-球蛋白 实验方法 一、盐析法粗分γ-球蛋白 二、凝胶过滤方法脱盐 三、离子交换层析方法纯化γ-球蛋白 四、醋酸纤维素薄膜电泳法鉴定γ-球蛋白的纯度 本实验综合多种实验技术和方法，共同完成一个实验目标，所以属于综合性实验。 * . 血清γ球蛋白的分离纯化与鉴定 【实验目的】 1．学习了解凝胶层析和离子交换层析分离纯化 蛋白质的基本原理及应用 2．掌握醋酸纤维薄膜电泳技术的原理及应用 * . 蛋白质分离纯化与鉴定 【基本原理】 蛋白质的分离、纯化及鉴定是研究蛋白质化学性质及生物学功能的重要手段之一。 分离纯化蛋白质的方法是利用不同蛋白质的某些物理、化学性质的不同而建立的方法，其中有盐析、离子交换、凝胶过滤、亲和层析、制备电泳、离心等。在分离纯化时，根据情况选用几种方法，相互配合才能达到分离纯化一种蛋白质的目的。 * . 血清γ球蛋白的分离纯化与鉴定 【实验原理】 本实验采用硫酸铵盐析、葡聚糖凝胶过滤、离子交换层析方法，分离纯化血清γ-球蛋白。最后用醋酸纤维素薄膜电泳法鉴定γ-球蛋白的纯度。 * . 一、盐析法粗分离血清γ-球蛋白 原理 盐析法是根据不同蛋白质在一定浓度的盐溶液中溶解度度不同，从而分别析出，达到彼此分离的分离方法。 本实验在半饱和硫酸铵溶液中，清蛋白溶解，球蛋白将沉淀析出，经离心所得的沉淀即为球蛋白的粗提液。 * . 盐析法分离血清球蛋白 硫酸铵是蛋白质盐析常用的中性盐，在0～30℃范围内溶解度变化不大；25℃时饱和溶解度为4.1 mol/l，0℃时饱和溶解度为3.9 mol/l。在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以析出来。而且硫酸铵价廉易得，分段盐析效果好，不容易引起蛋白质变性。 * . 具体操作 硫酸铵分段盐析：血清1.0 ml，一边摇一边缓慢加入饱和硫酸铵1.0 ml，混匀后室温下静置10分钟，3000 rpm离心10分钟。用滴管仔细地吸出上清，弃去。沉淀加0.02 mol/l pH 6.5 磷酸缓冲液4.0 ml溶解，此为球蛋白粗提液，留作进一步纯化。 * . 二、葡聚糖凝胶柱层析脱盐 欲去除盐析法分离得到的球蛋白粗提液中大量盐，通常有两种方法： 凝胶层析法 透析 本试验采用葡聚糖凝胶——Sephadex G 25层析方法除去球蛋白粗提液中的盐硫酸铵，以便下一步用离子交换层析方法进一步提纯球蛋白。