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紫杉醇前体依赖于MEP途径合成的分子调控机理Ⅱ —TcMCT和TcMCS基因的克隆与功能研究 植物学专业硕士研究生 杨颖舫 指导教师 廖志华 教授 西南大学生命科学学院 2010年6月4日星期六 * 目录 研究内容及技术路线 2 研究结果与分析 3 结论与展望 4 背景概况及目的 1 * 南方红豆杉的概况 种 名： 南方红豆杉 　　学 名： Taxus chinese 　　别名：刺柏松，紫杉，紫柏松 　　科属：红豆杉科、红豆杉属 　　保护等级：国家Ⅰ级重点保护野生植物（国务院1999年８月４日批准） 　　产地分布：产于我国长江流域以南，常生于海拔1000-1200m以下山林中，星散分布. 背景概况及目的 * 为什么要研究红豆杉 世界卫生组织（WHO）2008年12月9日发布报告称 2010年，癌症将超越心脏病成为全球头号杀手。而吸烟、摄入过多高脂肪食品、人口老龄化以及世界人口持续增长等因素是造成癌症患者与日俱增的原因。 WHO预计，在全球范围内，新增癌症病例和癌症患者死亡率也将会以每年1％的速度递增，而在中国、俄罗斯和印度这些国家增长速度会更快。 报告说：“全球癌症患者在上世纪最后30年里翻了一番，估计这一数字在2020年前将再翻一番，2030年前将增至上世纪最后30年的3倍。”这意味着到2030年，全球将新增2700万癌症病例，死于癌症的人数将达到1700万人。 背景概况及目的 * 紫杉醇一种高效的抗癌药物 紫杉醇是红豆杉属植物中的一种四环二萜化合物, 也是目前所了解的一种可以促进微管聚合和稳定已聚合微管的药物。 紫杉醇是一种有丝分裂抑制剂，使肿瘤细胞停止在G2期和M期，直至死亡，进而起到抗肿瘤作用。 紫杉醇还可调节体内的免疫功能，对肿瘤细胞起杀伤或抑制作用。 通过Ⅱ-Ⅲ临床研究，紫杉醇主要适用于卵巢癌和乳腺癌，对肺癌、大肠癌、黑色素瘤、头颈部癌、淋巴瘤、脑瘤有一定疗效。 紫杉醇 分 子 式：C47H51NO14 物理性质： 白色结晶体粉末。无臭，无味。不溶于水，易溶于氯仿、丙酮等有机溶剂。 背景概况及目的 * 紫杉醇合成研究 传统育种技术 培育红豆杉栽 培品种 紫杉醇的化学全合成和半合成 分离培养与红 豆杉共生的产 紫杉醇微生物 利用植物细胞培养技术生产紫杉醇 利用 基因 工程 遗传 改良 周期长效率低 步骤长产率低 副产物多 含量低菌种 易衰退 产量低 （1）红豆杉离体培养和遗传转化的成功，为利用基因工程技术遗传改良红豆杉奠定了良好的实践基础； （2）把植物次生代谢途径中的关键酶基因导入植物或其他物种中高效表达用于生产有用的次生代谢物质有诸多成功报道。 优势 背景概况及目的 * 紫杉醇生物合成的上游代谢途径 2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸胱氨酰转移酶 2-C-甲基赤藓醇-2，4-环焦磷酸合成酶 背景概况及目的 * 紫杉醇生物合成的下游代谢途径 背景概况及目的 * 基于RACE技术的同源性克隆方法克隆了南方红豆杉中的两个基因（MCT和MCS） TcMCT和TcMCS基因的功能验证 TcMCT基因的原核表达和酶活测定 TcMCT基因的组织差异表达 研究内容 * 技术路线 * A B C TcMCT基因的获得 研究结果与分析 基因克隆 * TcMCT 全长cDNA序列及编码的氨基酸序列 质体转运肽 全长： 1293-bp ORF：942-bp 5端非编码区：58-bp 3端：249-bp 编码313个氨基酸 分子量约为34.3 kDa 等电点： 研究结果与分析 基因克隆 * h表示α-螺旋，e表示β-片层，t表示β-转角， c表示随意卷曲 ； 30.13%的α-螺旋、21.15%β-片层、8.97%β-转角和39.74%随意卷曲构成。 TcMCT蛋白质的二级结构预测 基因克隆 研究结果与分析 * “★”表示CTP结合 位点 TcMCT氨基酸序列多重比对 红框表示MEP的结合位点 TcMCT分别与银杏(Ginkgo biloba)的MCT、和拟南芥(Arabidopsis thaliana)的MCT具有较高的同源性，同源性分别为59.3%、56.9%，相似性分别为69.1%、65.5%。 研究结果与分析 基因克隆 * 细菌来源MCT用○表示；植物来源用三角表示，其中被子植物用▲表示，裸子植物用△表示。分支上的数字为Bootstrap值(重复1000次)。 TcMCT系统进化树 基因克隆 研究结果与分析 * TcMCT三级结构预测 α-螺旋用红色螺旋状表示，β-片层用蓝色板状表示，随机卷曲用灰色绳状表示。锌离子结合位点用不同颜色小球标注出