金葡菌表型实验.docxVIP

金黄色葡萄球菌的相关表型试验方法 生长曲线的测定 （1）从37 C培育16-20小时的新奇平板中挑取一个单菌落，接种至含有1 mlTSB的10 ml培育管中。于37 ℃振荡培育（转速220 RPM）过夜。 （2） 1:100将菌转接入含有50 ml TSB, MH或PN培育基的250 ml烧瓶中,37 ℃震荡培育（转速220 RPM）o （3）每小时测量各瓶OD600数值，至细菌进入稳定期数值基本不再转变（约12小时）o 自溶试验 （1）从37 °C培育16-20小时的新奇平板中挑取单菌落，接种至TSB培育基中，于37 ℃振荡培育至指数中期。 （2）离心10 min,回收细胞。 （3）用PBS洗细胞，重复三次。 （4）将细胞重悬于等量含有 0.05% （W/V） Triton X-100 的 Tris-HCI （pH 7.5） 缓冲液中。 （5）将细胞重悬液于30 ℃振荡培育（转速220 RPM）。 （6）从测量零时开头，每隔30 min测量OD600的值，直到0D值降到初始 值的一半以下。 物膜试验 （1）从37 ℃培育16-20小时的新奇平板中挑取单菌落，接种至含有1 mlTSB的10 ml培育管中。于37 ℃振荡培育（转速220 RPM）过夜。 （2）将过夜培育的金葡菌依据1:100的接种量接种至新奇TSB培育基，混匀。 （3）将混合接种物分装至96孔板（Costar 3599）,每孔200 01或者24孔板 （Costar 3524）,每孔1000 Hlo在37 ℃恒温箱静置培育。 （4）培育肯定时间后，取出孔板，弃掉上清，并用水轻柔地洗孔板三次。 （5）每孔加入100国（96孔板）或500 01 （24孔板）结晶紫染色液，常温 下静置15 min染色。 （6）弃掉结晶紫染色液，用水轻柔地洗孔板三次，吹干。 （7）拍照，用酶标仪检测OD560度数。 alpha溶血素检测 （1）从37 ℃培育16-20小时的新奇平板中挑取单菌落，接种至含有1 mlTSB的10 ml培育管中。于37 ℃振荡培育（转速220 RPM）过夜。 （2）测量OD600并将不同的菌株调整至OD600全都。 （3）在羊血平板上分别滴上1 01金葡菌培育物，在37 ℃恒温箱静置培育24小时。 （4）观看菌落四周血细胞被溶解后形成的透亮环，拍照。 胞外蛋白酶试验 （1）从37 C培育16-20小时的新奇平板中挑取单菌落，接种至含有1 mlTSB的10 ml培育管中。于37 ℃振荡培育（转速220 RPM）过夜。 （2）测量OD600并将不同的菌株调整至OD600全都。 （3）在牛奶平板上分别滴上1 01金葡菌培育物，在37 °C恒温箱静置培育24小时。 （4）观看菌落四周牛奶蛋白被溶解后形成的透亮环，拍照。 万古霉素敏感性试验平板试验： （1）从37 C培育16-20小时的新奇平板中挑取单菌落，接种至含有1 mlTSB的10 ml培育管中。于37 。。振荡培育（转速220 RPM）过夜。 （2）测量OD600并调整至CFU约107 个/ml （约 OD600=0,05）。 1:10梯度稀释，并分别涂布置含有不同浓度万古霉素的MH平板。 37 ℃恒温箱静置培育24小时。 （5）观看并计数。 液体试验： （1）从37 ℃培育16?20小时的新奇平板中挑取单菌落，接种至含有1 mlTSB的10 ml培育管中。于37 ℃振荡培育（转速220 RPM）过夜。 （2）测量OD600并调整接种至10 ml MH培育基，CFU约107 个/ml。 （3）每小时测量各瓶OD600数值，至细菌进入稳定期数值基本不再转变（约 12小时）。 葡萄糖-6-磷酸诱导试验 （1）从37 ℃培育16-20小时的新奇平板中挑取单菌落，接种至含有1 mlTSB的10 ml培育管中。于37 ℃振荡培育（转速220 RPM）过夜。 （2）离心收集，用无菌PBS清洗三次，调整至OD600=1.0。 （3） 1:100接种至PN培育基，37 ℃振荡培育（转速220 RPM） 6小时。 （4）向培育物中添加葡萄糖-6-磷酸至终浓度5g/L,连续培育。 （5）在不同时间点分别收集1 ml菌液（添加前0 min,添加后lmin, 5 min, 30 min）,抽提 RNA。 金黄色葡萄球菌上清AI-2浓度检测 （1）收集菌液上清。将1:100接种的金葡菌每隔固定时间测量OD600的值并取200 HI菌液，4 ℃离心取上清，保存至-80 ℃待用。 （2）将上清化冻后，分别加样至专用发光检测96孔板，每孔20回1。 （3）将过夜培育的弧菌BB170依据发光强度1:5000到1:10000稀释，分装至发光检测板,每孔180 01 o （4）在30 ℃振荡培育，定时使用Veritas发光检测仪检测发光强度。 （