DB34∕T 4204-2022 猪圆环病毒3型套式PCR检测技术规程.docxVIP

ICS 11.220 CCS B 41 34 安 徽 省 地 方 标 准 DB34/T 4204—2022 猪圆环病毒3型套式PCR检测技术规程 Technical regulation for nested PCR detection method for porcine circovirus type 3 2022-06-29发布 2022-07-29实施 安徽省市场监督管理局 发布 DB34/T 4204—2022 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由安徽省动物疫病预防与控制中心提出。 本文件由安徽省农业农村厅归口。 本文件起草单位：安徽省动物疫病预防与控制中心、安徽农业大学、合肥市动物疫病预防控制中心、 萧县畜牧兽医水产服务中心、岳西县畜牧兽医水产服务中心、望江县畜牧兽医技术推广中心。 本文件主要起草人：何长生、陈静、黄晓慧、王立、纵丰学、王南山、李少炎、王倩、沈艳、王维、 范亚楠、苗文萍、陈曦、周迎春、王军、刘华、段倩倩、郑举、江定丰、沈岚、胡成威、朱良强、李郁。 I DB34/T 4204—2022 猪圆环病毒3型套式PCR检测技术规程 1 范围 本文件规定了猪圆环病毒病3型套式PCR检测方法的主要仪器设备、试剂、引物、样品采集、运输与 保存、样品处理、样品DNA提取、套式PCR扩增、结果判定、实验废弃物无害化处理、实验室分区、实验 室生物安全管理要求。 本文件适用于猪圆环病毒3型核酸套式PCR检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 SN/T 1193 基因检验实验室技术要求 《病死及病害动物无害化处理技术规范》（农医发〔2017〕25号 ） 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 猪圆环病毒3型 porcine circovirus type 3，PCV3 猪圆环病毒属于圆环病毒科、圆环病毒属，根据其致病性、抗原性及基因组序列分为1型、2型和3 型等基因型，猪圆环病毒3型是2015年发现的新型圆环病毒亚型。 4 主要仪器设备 PCR仪。 台式高速冷冻离心机：可控温至 4℃，离心力 12000 g 以上 全自动组织快速碾磨仪。 涡旋振荡器 冰箱：2℃～8℃、-20℃、-70℃ 三种。 电泳仪。 水平电泳槽。 凝胶成像系统 可调微量移液器：最大量程分别为 10 μL、50 μL、100 μL、1000 μL。 高压蒸汽灭菌锅 1 DB34/T 4204—2022 电子天平：精确度 0.001 g。 5 试剂 灭菌一级水：符合 GB/T 6682，121℃、20 min，高压蒸汽灭菌。 DNA提取纯化试剂盒：商品化试剂。 2×Easy TaqSuper Mix：商品化试剂。 0.5×TBE缓冲液： 称取 108g Tris 、7.44 g 枸橼酸钠 、55 g 硼酸，溶于 1000 mL 水中，配 成10×TBE缓冲液备用。使用时，取10×TBE缓冲液 25 mL，加水 475 mL，制成 0.5 ×TBE缓冲液。 1％琼脂糖： 称取 1 g琼脂糖 ，溶于 100 mL 0.5 ×TBE缓冲液中 。 磷酸盐缓冲液（PBS）：称取 8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na2HPO4和0.24 g KH2PO4，溶于 800 mL水中，用HCl调节溶液的pH值至 7.2，最后加水定容至 1 L，高压蒸气灭菌（121℃、至少 20 min）， 保存于室温或 4℃ 冰箱中。 无水乙醇：分析纯。 DNA核酸染料：商品化试剂。 DNA分子量标准：DL 2000 Marker，商品化试剂。 阳性对照样品： 70℃、30 min灭活的PCV3阳性病料上清。 阴性对照样品：灭菌一级水。 6 引物 引物序列见表1，委托有资质的公司进行合成。 表1猪圆环病毒3型套式PCR扩增引物 引物名称 引物序列 碱基数 扩增基因 扩增基因片段长度 第1轮扩增上游引物（F1） 第1轮扩增下游引物（R1） 第2轮扩增上游引物（F2） 5-CCACATGCGAGGGCGTTTAC -3 5-CCACAGCTGGCACATACTAC -3 5-CTTTGGTGCCGTAGAAGTCTG-3 20 20 21 Cap 6