葡聚糖凝胶层析实验报告.docxVIP

. . PAGE PAGE 1 / 3 一、实验目的 葡聚糖凝胶层析实验报告 1、学习凝胶Gel层析法的基本原理； 2、掌握葡聚糖凝胶〔Sephadex 柱层析的操作技术。 二、实验原理 凝胶层析又称排阻层析,凝胶过滤,渗透层析或分子筛层析等 。对于某种型号的凝胶,一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外,只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外〔所用洗脱液的体积为外水体积；而一些小分子不被排阻,可自由扩散,渗透进入凝胶内部的筛孔, 尔后又被流出的洗脱液带走〔所用洗脱液的体积为内水体积。分子越小,进入凝胶内部越深,所走的路程越多,故小分子最后流出柱外,而大分子先从柱中流出。一些中等大小的分子介于大分子与小分子之间, 只能进入一部分凝胶较大的孔隙,亦即部分排阻,因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。这样样品经过凝胶层析后,分子便按照从大到小的顺序依次流出,达到分离的目的。 三、仪器、材料和试剂 1、仪器：内直径为 1cm,外直径为 1.5cm 的层析柱,恒流泵、收集器、酶标仪、试管、烧杯、移液枪。 2、材料与试剂：交联葡聚糖、双蒸水、蛋白溶液样品。 四、实验步骤 1、装柱 将交联葡聚糖溶液用玻璃棒引流导入层析柱中,要注意,不能让柱子中有气泡,可以边装边用玻璃棒搅拌。 2、上样 装好柱后,用移液枪将柱子中上面的水吸出,再用移液枪将 1ml 的蛋白溶液加入层析柱中。 3、洗脱和收集 打开恒流泵和收集器装置,待样品刚好渗入到凝胶中时,再向层析柱中加入 3-4ml 的蒸馏水,此时盖上层析柱的上盖,将上盖的细管插入到盛有双蒸水的烧杯中,调节恒流泵的速度和收集器时间,开始洗脱收集。 4、样品的检测 收集一段时间后,将样品取出,依次编号,依次加入 200μl 到酶标版上,选用一个孔加入双蒸水作为对照,用酶标仪在 280nm 下测检测。五、实验结果及分析 序号吸光度A 序号 吸光度A 序号吸光 度A 2 0．05 1 16 0.055 4 6 8 10 12 14 0.045 0.051 0.071 0.195 0.127 0.067 18 20 22 24 26 28 0.039 0.066 0.027 0.053 0.049 0.011 2、蛋白质样品洗脱曲线： 收集样品时设置的时间为 3min 每管,收集得到每管的体积为 1.4ml,则计算： 流速=每管体积/每管时间=1.4/3=0.47ml/min。