基因工程操作程序.pptVIP

② EDTA Mg2+、Ca 2+的螯合剂，可抑制DNA酶的活性，防止DNA被酶降解。 ③ NaOH-SDS NaOH：强碱，提供pH12的碱性条件，使DNA双链变性。 SDS: 溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并结合成“蛋白—SDS”复合物，使蛋白质（包括DNA酶）变性沉淀。 冰醋酸把醋酸钾溶液的pH调到。 用来中和NaOH变性液，使DNA复性。 高浓度的K+置换Na+,生成不溶的PDS 用于沉淀DNA。 ⑤ 乙醇 DNA分子以水合状态“溶于”水里，乙醇能夺去DNA分子的水环境。 ④ KAc-HAc缓冲液 ⑥ RNase A 降解RNA渣滓。 以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。 ⑦ TE缓冲液 DNA保存液。 由Tris-HCl和EDTA配制。 Tris-HCl维持溶液中pH值相对稳定； EDTA抑制DNA酶，防止DNA被酶降解。 蛋白变性剂，进一步抽提DNA溶液中的蛋白质，使蛋白质沉淀。 但苯酚会残留在DNA溶液中。 （现多用各种商品化的层析柱纯化DNA)。 ⑧ 酚-氯仿 选用 以上试剂有商业试剂盒；也可以自己配制。 （3）碱抽提法提取质粒DNA的步骤 Solution I 的配制： 使用“溶液Ⅰ”悬浮菌体。 第一步：悬浮菌体 25mM Tris-HCl(pH8.0)， 10mM EDTA， 溶液II 破坏细胞膜，蛋白质和DNA变性。 第二步：破膜，蛋白质和DNA变性 Solution II 的配制： 第三步：中和 溶液III使DNA复性、并促使蛋白质-SDS复合物和染色体DNA沉淀。 Solution III的配制： 0.2N NaOH，1.0%SDS 5M 乙酸钾（用冰醋酸调pH至） 上清液中含有闭合质粒DNA。 第四步：离心除去沉淀 倍体积的异丙醇或2倍体积的乙醇。 第五步：纯化DNA 上清液过柱或酚-氯仿抽提。 第六步：沉淀DNA 与待扩增的模板DNA区段的两3’端序列互补（ 5‘端相同）的短DNA。 ①位置 3’ 3’ 引物设计现在多用专业软件 如等 二、引物（primer) 设计 ②引物的长度 一般引物设计为长18—30bp。 ③引物的特异性 引物应与核苷酸序列数据库的其他序列无明显同源性。 ④引物的碱基序列 5’端根据需要可设计成某个内切酶的切点顺序、RNA聚合酶识别序列、突变位点或生物素标记等，方便与以后操作。 5’ATGCAGAAACTGATCGATCGATCGAT3’ 3’GCTAGCTACTTAAG5’ 3‘端（特别是最末及倒数三个碱基）必须与模板严格配对，5’端可以不配对。 template primer 尽可能提高G+C含量，以提高引物与模板的结合力, G+C含量以 45%-65%为宜。 ⑤引物的碱基组成 避免连续4个以上相同碱基排列或内部回文序列. 5’GGCAGTCTGCCAGTCTAC3’ CTGCCAGTCTAC3’ GACGG5’ T 发卡结构 1） 2） 3）避免形成引物二聚体（dimer） 两个引物之间不能有两个以上的连续碱基序列互补。 5’GGTCTGCCAGTCTAC3’ 3’CAGGACTTAGTCACT5’ primer1 primer2 ⑥引物的Tm值 Tm=（G+C)?4 + (A+T)?2 适当提高复性温度可以提高引物与模板结合的特异性，减少非特异产物的出现。 实际复性温度选择低于Tm值5-10 oC。 经验公式计算： Tm值是指溶液中有半数的DNA分子解链为单链时的温度。两条引物的Tm值尽可能相等或相近，最好相差不超过2 oC。 三、增加PCR特异性的措施 （1）引物设计 （2）引物的退火温度 （3）循环次数 （4）Taq DNA聚合酶，利用高保真DNA聚合酶 （5）降落PCR （6）热启动PCR （7）巢式PCR 四. PCR技术的扩展 （1）巢式PCR (nest PCR) 　 此时进行二步PCR，第二级PCR需另行设置反应体系，并应用另外的PCR引物，此时引物的位置位于初级PCR引物的内侧，用初级PCR产物做模板，进行第二步不饱和PCR扩增，这样只有初级PCR中特异的扩增片段才能被二级引物扩增。 　　　除了提高PCR的产量外，还提高了最终产物的特异性。 为了增加产物的特异性，设计2组引物（套嵌引物），结合位点依次位于前一组引物之间，进行2轮扩增。第一轮的PCR产物稀释100-200倍作为下一轮的扩增模板，进行不饱和扩增（10-15 cycles）。 1 3 2 4 （2）热启动PCR (hot start PCR) 94℃ 4 min (预变性) 94℃ 30 sec, 60℃ 30 sec, 72℃ 2 min 72℃ 7 min