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苏云金芽孢杆菌cry1Da5基因的克隆与表达 　　摘要：采用5对引物组合经2轮pcr扩增对苏云金芽孢杆菌ql75-2菌株中的cry基因进行鉴定，克隆得到1个cry1da型基因片段。通过设计全长引物扩增得到该cry基因的全长序列，转入原核表达载体pet-28a中，在大肠杆菌bl21（de3）中进行表达，最后对表达蛋白进行生物活性分析。序列分析结果表明，该cry1da基因全长3495bp，推测其编码1164个氨基酸，组成分子量约132.01ku的蛋白质。该预测蛋白质与已知的cry1da3蛋白质具有最高的序列同源性（99.7%），该基因被国际杀虫晶体蛋白基因命名委员会正式命名为cry1da5。生物活性分析结果表明，cry1da5蛋白质对鳞翅目的甜菜夜蛾幼虫具有较强的杀虫活性，其lc50为21.47μg/ml，而对鳞翅目的棉铃虫幼虫无杀虫活性。因此，cry1da5基因可作为一个新的cry基因资源在甜菜夜蛾的生物防治中应用。 　　关键词：苏云金芽孢杆菌;简并引物;cry1da5基因;棉铃虫;甜菜夜蛾;杀虫活性 　　中图分类号：s182 　　文献标志码：a 　　文章编号：1002-1302（2020）02-0118-05 　　收稿日期：2018-10-26 　　作者简介：关鹏（1984—），男，陕西渭南人，博士，讲师，主要从事微生物杀虫剂研究。e-mail：guanpeng0719@163.com。 　　苏云金芽孢杆菌（bacillusthuringiensis，bt）在芽孢形成过程中能够产生形态多样的伴胞晶体（又称杀虫晶体蛋白或δ-内毒素，由cry、cyt基因编码），这些伴胞晶体对鳞翅目、鞘翅目、双翅目、膜翅目、直翅目、螨类、线虫等农林及卫生害虫具有特异性的杀虫活性[1-2]，因此bt菌株及其杀虫基因被广泛应用于农林、卫生害虫的生物防治。 　　在已知的75类cry基因中，cry1类基因编码蛋白主要对鳞翅目害虫具有广泛的杀虫活性，然而不同的cry1类蛋白存在不同的杀虫谱。例如cry1ac和cry1ca对棉铃虫（helicoverpaarmigera）、甜菜夜蛾（spodopteraexigua）幼虫均有显著的杀虫活性[3-5];棉铃象甲（anthonomusgrandis）和草地夜蛾（spodopterafrugiperda）幼虫对cry1ia敏感[6];cry1ab和cry1fa主要对玉米螟（cornbore）、草地夜蛾幼虫具有较强的杀虫活性[7];cry1da对甜菜夜蛾、小菜蛾（plutellaxylostella）等夜蛾科害虫具有明显的杀虫活性[8-10]。 　　cry基因的鉴定多采用宋福平等建立的限制性片段长度多态性聚合酶链反应（pcr-rflp）基因鉴定体系[11]，通过对同一大类的不同cry基因进行序列比对，根据保守区域设计该类型cry基因的通用引物，然后利用pcr的方法对bt菌株中的cry基因片段进行扩增，并采用不同的dna内切酶对扩增产物进行双酶切鉴定。本研究采用的是berón等创建的一种新的cry基因鉴定方法[12]，首先对不同大类cry基因编码蛋白质序列进行比对，得到蛋白质的保守区域，然后根据其对应的核酸序列，分别设计5条简并引物，然后通过2轮pcr扩增，并结合测序方法对btql75-2菌株中的cry基因进行鉴定、全长扩增及原核表达，并对表达产物进行杀虫活性分析。 　　1材料与方法 　　1.1材料 　　1.1.1供试菌株野生型苏云金芽孢杆菌ql75-2菌株、大肠杆菌dh5α感受态细胞由笔者所在实验室保存。 　　1.1.2供试昆虫棉铃虫、甜菜夜蛾幼虫为笔者所在实验室饲养的标准化测试昆虫。 　　1.1.3培养基lb（luria-bertani）液体培养基：称取10g蛋白胨、10gnacl、5g酵母提取物，加无菌水定容至1000ml;lb固体培养基：在lb液体培养基中加入1.5%琼脂粉;1/2lb液体培养基：将lb液体培养基中的各成分均减半后，加无菌水定容至1000ml;1/2lb固體培养基：在1/2lb液体培养基中加入1.5%琼脂粉。将配制好的培养基置于121℃条件下高温蒸汽灭菌20min。 　　1.1.4试剂pmd19-t载体、t4dna连接酶购自日本takara公司;dnamarker、蛋白质marker、氨苄青霉素、x-gal、异丙基-β-d-硫代半乳糖苷（iptg）、taqdna聚合酶、pfudna聚合酶购自北京全式金生物技术有限公司;axygendna凝胶回收试剂盒、axygen质粒小量提取试剂盒购自上海百赛生物技术股份有限公司。 　　1.2方法 　　1.2.1bt质粒d