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叶酸介导VEGF对糖尿病肾病大鼠足微循环影响研究 　　【摘要】目的：叶酸介导vegf对糖尿病肾病大鼠足微循环影响研究。方法：将25只健康雄性sd大鼠适应性喂养1周后随机分为2组，分别为正常组（5只）和造模组（20只）。给模型组大鼠每天喂高脂高糖日粮，正常组喂基础日粮。4周之后称量体重，给予造模大鼠空腹腹腔注射1%的链脲佐菌素溶液（stz，30mg/kg），正常组注射相等容量的柠檬酸盐缓冲液。在喂养2周过后，测定正常组与模型组的血糖和胰岛素水平。用基础饲料继续喂养造模后的大鼠和正常组大鼠。模型大鼠随机分为stz组、和低剂量（1.5mg/kg）、中剂量（3.5mg/kg）、高剂量（5.5mg/kg）叶酸组进行干预，再检测大鼠鼠尾血糖浓度。各组均在干预灌胃3d后在心脏处取血制备血清。将完全培养基底加入到面积75cm2的培养瓶中行小鼠足细胞培养。将正常组和模型组小鼠足细胞的培养依次分为空白对照组、stz组、正常鼠血清对照组和添加低、中、高剂量叶酸血清组共六组。刺激24h之后用酶联免疫吸附试验（elisa）检测大鼠血清vegf水平，pcr技术检测mrna中vegf水平，后用蛋白质印迹法（wb）检测蛋白质vegf表达水平。结果：vegf的阳性表达可以在高糖组和正常鼠血清组小鼠足细胞观察到。添加叶酸的血清组足细胞vegf在蛋白质和mrna中的表达比高糖组和正常鼠血清组中的表达明显降低，差异具有统计学意义。结论：叶酸能够介导血管内皮因子（vegf）水平从而改善糖尿病肾病大鼠足的微循环。 　　【关键词】叶酸糖尿病肾病足细胞血管生长内皮因子 　　一、材料 　　（一）动物 　　健康雄性sd大鼠25只，體重200～220g。 　　（二）药物 　　叶酸片购于天津力生叶酸片。分别配置低（1.5mg/kg）、中（3.5mg/kg）、高剂量（5.5mg/kg）叶酸。 　　二、实验方法 　　（一）分组与细胞培养 　　将25只健康雄性sd大鼠在基础喂养1周后随机分为2组，分别是正常组（5只）和造模组（20只）。模型组大鼠喂每日喂养高脂高糖饲料。正常组喂以基础饲料。4周后，称重。造模大鼠空腹腹腔注射1%的链脲佐菌素溶液（stz，30mg/kg），正常组注射相同体积柠檬酸盐缓冲液。在喂养2周后测量血糖和胰岛素水平，模型组大鼠和正常组大鼠继续喂食基础饲料。随后将成模大鼠随机分为正常对照组、1%链脲佐菌素溶液组（30mg/kg）和低（1.5mg/kg）、中（3.5mg/kg）、高剂量（5.5mg/kg）叶酸并注射1%链脲佐菌素溶液组（30mg/kg）组进行干预，干预后检测鼠尾血糖浓度。在灌胃3天后心脏取血制备血清。小鼠足细胞培养：将完全培养基加入到底面积为75cm2的培养瓶中进行培养。 　　（二）指标检测 　　（1）酶联免疫吸附试验（elisa）运用双抗体夹心elisa法检测血管内皮因子vegf在大鼠血清中的浓度。通过计算确定实验所需的板条数量，并将其取出后再放置于框架中。设置空白孔并仅添加tmb显色液和终止液在空白孔中。对每次实验进行标准测试，并绘制出标准曲线。将不同浓度标准品加入到相应孔中，并在室温下温育120分钟。将板洗涤5次并加入生物素化的抗体工作溶液。在室温下孵育60分钟。将板洗涤5次，加入酶结合物工作溶液，在室温下进行避光孵育20分钟。将板洗涤5次，再加入显色剂tmb100ul/孔，黑暗中温室孵育20分钟，加入50ul/孔的终止液，混合均匀后立刻测量od450的值。 　　（2）荧光实时定量pcr技术用于检测mrna中vegf水平。首先提取细胞中总rna并在培养瓶中加入1mltrizol，在15分钟后将细胞收集到ep管中，将每只管中加入200μl的三氯甲烷混匀后4℃12000rpm/min中离心20分钟。将取得的上层水相移到新的ep管后，将等量的异丙醇混匀后加入其中再冰上静置15分钟。于4℃12000rpm/min离心20分钟后，弃去上清液并干燥。用75%的无水乙醇lml充分冲洗rna沉淀后再次进行离心，弃去上清液后于室温干燥。用适量1%的depc水来溶解rna，后用枪轻轻吹打将其混匀，品质鉴定rna样品。混匀pcr混合物并将其室温孵育1h。95℃预变性10分钟，95℃变秒10秒，60℃退火20秒，72℃延伸15秒，进行40个循环后记录ct值。将gapdh作为内参，采用2—△△ct方法分析，对照组为1，计算其余各组相对表达量的情况。 　　（3）免疫印迹法蛋白质印迹法（westernblot）分析蛋白质中vegf的表达水平 　　（三）统计学方法 　　使用spss17.0软件进行数据分析。测量数据中计量资料表示为均数±标准差，统计方法使用