原核表达的详细步骤.pdfVIP

原核表达详细步骤 PartⅠ选择表达的目的基因 一、 基因序列 1. 得到靶基因 DNA （cDNA)序列,有几种方式寻找正确的读码顺序： ① 利用生物信息学在 NCBI 上 blast 同源基因，找到同源蛋白，再在DNA 的ORF 中找到正确的读码。 ② 实验方法，即得到蛋白,进行测序,然后在 DNA 上找到正确的读码。 ③ 利用 mRNA 的特征，找到启动子，编码区，终止子.在编码区中找到翻译 起始密码子与终止密码子 (cDNA）。 2. 注意事项： ①区别 ORF 和 CDS→ORF 一般在 DNA 上的定义，寻找原则是翻译起始密码子和终 止密码子；CDS 可以是 DNA 上的定义,也可以是 mRNA 上的定义,分为 complete CDS 和 partial CDS，是从第一个核酸开始读，连续读下去，complete CDS 读码是 “M、、、、、、、、、＊”,partial CDS的读码是相应的AA ②在进行试验设计时，充分利用生物信息学的信息后，在进行试验设计。 二、 抗原决定簇的预测 1、 原理: 蛋白质表面部分可以使免疫系统产生抗体的区域叫抗原决定簇。一般抗原决定簇 是由 6－12 氨基酸或碳水基团组成，它可以是由连续序列（蛋白质一级结构） 组成或由不连续的蛋白质三维结构组成。变性蛋白只是天然蛋白伸直的了产物， 用来免疫动物具有更强的抗原性.只是天然蛋白中被包在内部的抗原决定簇也会 暴露出来,如果用该变性抗原制备的抗体来检测变性抗原是可以的，如果用来检 测天然蛋白,可能会有假阳性.做单抗也可以,同样道理,筛选出的单抗可能对抗 的抗原决定簇处于天然抗原的内部，是否能用还要看将来该单抗用来干什么。 2、 选择原则： （1）、亲水性:大部分抗原决定簇是亲水性的。 (2)、处于结构表面 :大部分抗体只与蛋白质表面部分结合。 （3）、有弹性：许多已知的抗原决定簇是在自由活动区域。所以一般来说蛋白 质的 N 端及 C 端是很好的抗原决定簇区域。 3、选定抗原决定簇的步骤：（1）预测：如软件预测DNAstar （Protean)预测， Dnaman.在线网站预测 (http：//www-bimas。cit。nih。 gov/molbio/hla_bind/index.shtml and http：//www。imtech.res。 in/raghava/propred/algorithm.html ） （2）选定:接近 N、C 端；选取在此区间内， （Antigenic Index）Jameson—wolf 抗原决定簇选正分高处；（Hydrophilicity plot）Kyte-Doolittle 预测亲水性 强的区域。同时符合以上 3 点的区域较好（命名为多肽片断 A）。 注：如果设计的多肽是跨膜蛋白，请尽量回避选择蛋白的跨膜区,即头端信号肽 所在的区域 （3）NCBI(BlastP ）比对：将多肽片断A 放入 blastp 进行同源性比对。如果制 备某一动物种属的抗体，该区必须与该动物的氨基酸序列没有较高的同源性. 注：这一步往往容易漏掉,所以学会应用生物信息学，可以减少走弯路！!! （4)抗原合成: ①原核表达： ②化学合成：需要做化学偶联增强多肽稳定性。多肽的纯度越纯越好，一般〉 80% 就完全可以了。合成 5-10 mg 就可以了. PartⅡ选择表达系统 一、 选择表达载体 1、选择表达载体的原则 （1)蛋白质大小：决定在胞质中表达还是以包涵体的形式表达,是否加标签或以 融合蛋白的形式表达。 (2）蛋白需求量:根据实验方案确定蛋白需求量,选择合适的载体。 （3）蛋白质是否需要保留活性：有活性的可溶性蛋白表达(胞质蛋白），无活性 的不溶的蛋白（包涵体蛋白) 2、原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件： （1)选择标志的编码序列：用于筛选重组子,有抗生素抗性基因 、报告基因 （GF 等) （2)可控转录的启动子： 启动子是 DNA 链上一段能与 RNA 聚合酶结合并起始 RNA 合成的序列，它是基因表 达不可缺少的重要调控序列.启动子的强弱是对表达量有决定影响的因素之一。 没有启动子，基因就不能转录.由于细菌RNA 聚合酶不能识别真核基因