动物心梗实验设计方案.pdfVIP

联系个人所学专业，选取某种或某类疾病，设计相关实验的动物模型，详细描述 其方法及步骤，并阐述所选动物种类和级别的理由以及该动物日常生活和实验的 环境要求（包括进出该环境的顺序），实验过程中的注意事项 MicroRNA—378(miR—378 ）在心肌肥厚中的研究 一、实验原理： microRNA （miRNA ）是一类小分子非编码单链RNA ，长约22 个碱基,能通过与 靶 mRNA3’非翻译区(3UTR ）互补配对，使其翻译受到抑制,从而在转录后水平 对生物体内基因时序性表达起到精细调节作用.miRNA 的表达变化与心肌肥厚的 发生、发展密切相关.本实验通过异丙肾上腺素和去甲肾上腺素诱导实验动物心 肌肥厚,然后用PCR 技术测定心肌细胞中miRNA 的变化. 二、实验目的: 通过统计学方法观察miRNA 在正常心肌细胞和心肌肥厚的心肌细胞中的差异， 从而将miRNA 作为诊断心肌肥厚的潜在的生物学标志。 三、实验材料及步骤：Wistar 雄性大鼠30 只（200～250g/只,SPF 级别），异丙肾 上腺素(ISO），去甲肾上腺素（NE ），生理盐水。 3.1 分组及造模 3 。1.1 采用随机数表的方法讲30 只wistar 大鼠随机分成三组，每组 10 只,分别 为对照组、ISO 处理组、NE 组. 3.1 。2ISO 处理组：10 只大鼠连续7 天背部皮下注射ISO （4 mg/kg/天），制成 心肌肥厚模型. NE 处理组：10 只大鼠连续7 天背部皮下注射NE （4 mg/kg/天），制成心肌肥厚 模型. 对照组：10 只大鼠同法背部皮下注射生理盐水（4 mg/kg/天)，制成心肌肥厚模 型. 3 。2 检测造模是否成功 3 。2 。1 高频超声检测 分别于造模后第2 周，称取大鼠质量，10%水合氯醛麻醉大鼠后，仰卧固定,将其 胸前部剃毛，应用TOSHIBA—6000 超声诊断仪,频率为7.5 MHz 的探头置于其 胸左侧，取径(LVEDD，LVESD)。左室射血分数（EF,%)、左室短轴缩短率(FS，%）、 计算左室左室长轴切面，图像深度调至3 。0 cm，由二维超声引导,将M 型超声 取样线置于二尖瓣腱索水平，垂直于室间隔及左室后壁，经M 型超声曲线进行 测量,每一超声测定值取3 个连续心动周期测量均值.超声测量指标:舒张末期及收 缩末期室间隔厚度 (IVSTd ，IVSVTs ）、舒张末期及收缩末期左室后壁厚度 （LVPWTd，LVPWTs)、舒张末期及收缩末期左室内质量（LVM，mg ）. 3 。2 。2 大鼠心肌质量指数的测定 称取大鼠体质量（body weight ， BW ）,摘眼球取血备用,脱颈椎处死,快速打开胸 腔取心脏,去除心房组织,分离左、右心室，生理盐水漂洗去血，用滤纸吸干表面 水分, 电子天平准确称取左心室质量（left ventricle weight ， LVW)和全心质量 （heart weight, HW ）.计算左心室质量与体质量的比值（LVW/BW)、全心质量与 体质量的比值(HW/BW ）,分别记为左心室质量指数（left ventricular weight index ， LVWI）和全心质量指数（heart weight index, HWI ）。 3 。2 。3 心肌细胞横断面面积测定 每组随机取3 只大鼠，取左心室中段，10％福尔马林液固定的心肌组织经乙醇梯 度脱水、透明、浸蜡包埋后，切成5 μm 的切片，将左心室心肌进行HE 染色,选 择横断心肌的切片（细胞核清晰,细胞膜完整）放大400 倍。用Image Pro Plus 4 。 0 图像分析软件,测量左心室心肌细胞横断面面积。每一标本随机测量20 个心肌 细胞，计算其细胞平均横断面面积。 3.3 测量miR—378 水平 3.3.1 RNA 提取:用RNA 提取试剂盒提取各组大鼠先前在3.2.2 中备用的血中的 RNA ，一切步骤按照试剂盒说明书。 3 。3.2 逆转录:将提取的RNA 作为模板加入到20µlPCR 体系中，在一定的反应 条件下反应成 cDNA. 3 。3 。3miR—378 水平的检测:将 3 。3.2 中反应的 cDNA 作为模板在 20µlPCR 体系中,在一定的反应条件下进行实时荧光定量PCR 反应。 3 。3.4 用统计学方