第二章 基因工程制药.pptVIP

(1)目的产物在初始原料中的含量较低; (2)含目的产物的初始物料组成复杂； 除了目的产物外,还有大量的细胞、代谢、残留培养基、无机盐等，特别是产物类似物对目的产物的分离纯化影响很大； 基因工程药物（生物技术）的特点 (3)目的产物的稳定性差； 具有生物活性的物质对pH、温度、金属离子、有机溶剂、剪切力、表面张力等十分敏感，容易是其失活、变性 (4)产物种类繁多； 包括大、中、小分子、结构简单或复杂的有机化合物，以及结构复杂又性质各异的生物活性物质。 (5)应用面广，对其质量、纯度要求高，甚至要求无菌、无热源。 分离纯化工艺的根据 1、含目的产物的起始物料的特点： 利用基因工程菌进行发酵生产的产物，其上游过程中的各种因素均对分离纯化技术和工艺有直接影响。 （1）菌种类型及其代谢特性：包括菌种的生物学性质，产物和副产物种类、产物在细胞内所处的位置，表达方式（胞内、胞外、包含体），代谢物种类、产物类似物、毒素和能降解产物的酶类等； （2）原材料和培养基的来源及其质量； （3）生产工艺和条件： 包括灭菌方式和条件，生产方式（连续、批式、半连续），生产周期，生产能力，工艺控制条件因素几方式等； （4）初始物料的物理、化学和生物学特性： 包括产物浓度、主要杂质种类和浓度、盐的种类和浓度、溶解度、pH、黏度、流体力学性质和热力学性质。 2、物料中杂质的种类和性质物料中杂质的含量、性质、结构、相对分子质量、电荷性质及数量、生物学特性、稳定性、溶解度、分配系数、挥发性、吸附性能等。 3、目的产物特性 产物的化学、物理和生物学特性，包括化学组成、相对分子质量、等电点、电荷分布及密度、溶解度、稳定性、疏水性、扩散性、扩散系数、分配系数、吸附性能、生物学活性、亲和性、配基种类、表面活性等。 4、产品质量的要求 产品质量标准和用途对产品纯度、生物活性、比活的要求。包括允许的杂质种类和最大允许含量，特殊杂质的种类和最大允许量，以及杂质对使用的影响，产品剂型、贮存稳定性等。 分离纯化的技术 一、分离纯化技术要求 二、分离纯化的技术 1、细胞破碎与固液分离 2、目的产物的分离纯化 3、非蛋白质杂质的去除 三、常用分离方法的比较 分离纯化技术要求 （1）技术条件要温和，能保持目的产物的生物活性； （2）选择性要好，能从复杂的混合物中有效的地将目 的产物分离出来，达到较高纯化倍数； （3）收率要高； （4）两个技术之间要能直接衔接，不需要对物料加以处理或调整，这样可减少工艺步骤； （5）整个分离纯化过程要快，能够满足高生产率的要求。 （1）细胞收集：离心和膜过滤 （2）细胞破碎： 机械法高压匀浆、超声波、高速珠磨、高压挤压等。 非机械法酶溶、化学渗透、热处理、渗透压冲击法。 （3）固液分离：分离细胞碎片是比较困难。一般用离心和膜过滤。 1、细胞破碎与固液分离 分离纯化目的产物主要依赖于色谱分离技术（离子交换层析、反相色谱、亲和层析、凝胶过滤等）。 2、目的产物的分离纯化 ⑴离子交换层析（ ion exchange chromatography IEC） 离子交换层析的基本原理: 通过带电的溶质分子与离子交换剂中可交换的离子进行交换，从而达到分离的目的。它具有分辨率高容量大操作容易，该法已成为多肽蛋白质核酸分离纯化的重要方法。 ⑵反相色谱（reversed phase chromatography，RPC）和疏水色谱（hydrophobic interaction chromatography，HIC） 反相色谱和疏水色谱是根据蛋白质疏水性的差异来分离纯化的。 反相色谱是利用溶质分子中非极性基团与非极性固定相之间相互作用力的大小以及溶质分子中极性基团与流动相中极性分子之间在相反方向作用力的大小差异进行分离的。 常用固定相为硅胶烷基键合相。 流动相为低离子强度的酸性水溶液，加入能与水互溶的乙腈、甲醇、异丙醇等有机溶剂。 由于固定相骨架疏水性强，吸附的蛋白质需用有机溶剂才能洗脱下来。 疏水色谱的原理与反相色谱的原理相似，主要是利用蛋白质分子表面上的疏水区域和介质中的疏水基团之间的相互作用，无机盐的存在能使相互作用力增强。 固定相介质表面的疏水性比反相色谱介质表面的疏水性弱。为有机聚合物键合相或大孔硅胶键合相。 流动相为pH6～8盐水溶液。 在高盐浓度时，蛋白质分子中疏水性部分与介子的疏水基团产生疏水性作用而被吸附；盐浓度降低时蛋白质疏水性作用减弱，目的蛋白质被逐步洗脱下来，蛋白质疏水性越强，洗脱时间越长。 与反相色谱相比，疏水色谱回收率较高，蛋白质变性可能性小。 ⑶亲和层析（affinity chromatography，AC） 亲和层析是利用固定化配基与目的蛋白质之间特异的生物亲和力进行吸附，如抗体与抗原、受体与激素、酶与底物之间的作用。