《定点诱变技术》.ppt

第三章 DNA突变技术;基因突变包括单个碱基或片断的替换，基因片断的插入与删除等。 根据其特点可将基因突变技术分两大类： 1.位点特异性突变 定点突变 2.随机突变 表型筛选 ;随机突变 易错PCR法(Error-prone PCR) 降低一种dNTP的量（降至5％-10％） 加入dITP来代替被减少的dNTP 缓冲液中另加0.5mmol/L Mn2+ DNA Shuffling 外显子、单基因和基因家族的重组装 随机引物延伸法 交错延伸法 定点突变 点突变——碱基删除、增补和替换;易错PCR(epPCR) ;How DNA shuffling is done in the tube Random fragmentation of a pool of related genes; Self-priming polymerase reaction and template switching (causing crossovers); PCR amplification with primers of reassembled products ;How DNA shuffling works ？;;DNA 重组装的过程;磷脂酶热稳定－催化活性的分子进化 （Jae Kwang Song等，2000）;β-葡糖苷酶耐热性的提高 (Mary′a Jesu′ s Arrizubieta等，2000）;耐热p-硝基苯酯酶的分子进化 (Lori Giver等，1998）; The fucosidase activity are shown with stick representation. Two mutations in the active site (Asp604 and Gln573) are shown in red. Two mutations in close proximity of the active site (Pro511 and Asp908) are shown in magenta. Two mutations far away from the active site and on the protein surface (Val9 and Gln135) are shown in green. The rest of the substrate binding and active site residues are shown in yellow..;二、随机引物PCR(RPR)和重组装;多功能氧化酶的定向进化 （Hikaru Suenaga等,2001）;三、交错延伸PCR突变法(StEP);枯草杆菌蛋白酶E热稳定性的分子进化 （Huimin Zhao等，1999）;进化的热稳定性枯草芽孢杆菌蛋白酶E的突变谱系;进化后的枯草杆菌蛋白酶E;芽孢杆菌脲酸酶的定向 进化 （Su-Hua Huang等,2004）;定点突变的研究意义;定点突变的类型;DNA定点突变的种类 寡聚核苷酸介导 替换、插入、删除 盒式突变 PCR介导;;寡聚核苷酸介导法; 在正常情况下，尿嘧啶-Ｎ-糖基化酶(ung+)可以去除掺入DNA中的尿嘧啶残基。但在ung-的菌株中，此酶失活。 在大肠杆菌dut- ung-菌株中生长的M13噬菌体的单链基因组DNA中将含有20-30个尿嘧啶残基。用这些噬菌体感染ung+菌株，尿嘧啶被迅速去除，DNA链遭到破坏，感染力下降约5个数量级。 此法的成功??键，是要得到好的含Ｕ单链模板DNA。;无5‘-3’外切活性 3‘-5’外切活性低; 这种方法得到的突变率太低，约为1-5%。主要原因是含突变位点的双链DNA，转入E.coli后，被其修复系统修复了。;盒 式 定 点 突 变;PCR介导的基因突变;在基因5’和3’末端产生突变;重叠延伸法定点突变技术的原理示意图;重叠延伸PCR法小结;;;大引物PCR介导的定点突变;各种点突变方法的比较;应用产品;;一种简便快速的定点突变的方法;Overview of the QuikChange? XL site-directed mutagenesis method.;Steps of Muta-direct? Site-Directed Mutagenesis Kit;Overview of the QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis method;Steps of Multipoints Mutagenesis Kit (TaKaRa)