基因工程动物细胞培养制药工艺.pptVIP

(四)流化床生物反应器 细胞固定在多孔微载体中，培养基以适当的流速自下而上经过，使多孔载体处于悬浮的流态的反应器。Verax公司CF－IMMO多级和SF－2000流化床反应器，用于生产疫苗和基因工程产品。 上部微载体依靠沉降作用与培养基分离，一部分培养基被收集，提取产物，同时排出部分废物；其余部分再流加等体积新培养基，提供营养，实现高密度培养。 这种反应器结构比较简单，传质性能好，采用膜气体交换器，能快速提供氧气。 第九十四页，共一百四十九页。 固定床反应器： 填料为无细胞毒性的生物兼容性可附着细胞的惰性材料，可以是不锈钢、玻璃陶瓷和塑料和合成高分子材料。 与流化床反应器的区别为固定床反应器使用实心载体，流化床反应器使用有孔载体。 现用多级流化床和多孔微球培养。 第九十五页，共一百四十九页。 （五）中空纤维生物反应器 一个特制的圆筒，内部装有数千根中空纤维管束。 接种孔 水套层 产物出口 培养基入口 产物出口 培养基入口 内膜 外膜 腔室 细胞 培养基分散后,灌入床层。纤维管壁薄，半透膜，截留不同分子量。 纤维管的空腔组成的内室：灌流含氧气的培养基 纤维管之间的空间组成的外室：细胞生长。 第九十六页，共一百四十九页。 细胞接种于外室，贴附在纤维外壁，吸收从内室渗透出来的营养成分，生长繁殖。 1－3周后可占据所有的纤维空间，并在纤维外壁表面上堆积成多层，细胞密度可达108/ml。 细胞分泌的产物和血清中的成分由于分子量较大而无法进入内室，产物只能在外室积累和浓缩。 细胞代谢的废物是小分子物质，可渗透进入内室，从内腔开口排出，避免了对细胞的毒性。 在收获时，打开纤维管之间的外室开口，产物就流出来。此时虽然细胞停止分裂，但细胞的存活、健康和核形态不变，代谢和分化功能仍可保持数月。 第九十七页，共一百四十九页。 纤维材料:聚砜、丙烯共聚物、聚丙烯、纤维素、醋酸纤维素、聚甲基丙烯酸甲酯等。纤维素亲水性强，对渗透性影响较大，不适合于Vero细胞及其他贴壁细胞培养。醋酸纤维和聚甲基丙烯酸甲酯亲水性弱，极性大，适宜于贴壁细胞培养。 优点:占地小，产量和质量高，成本低。 不足:不能重复使用，不耐高压灭菌，只能用环氧乙烷等消毒剂灭菌，不能取样检测。 中空纤维反应器是模仿了生物体内毛细血管系统，应用广泛，主要用于培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体。已有多家公司生产制造和销售中空纤维生物反应器，其发展的趋势是达到高密度培养的目的。 第九十八页，共一百四十九页。 第五节 动物细胞的增殖行为与培养过程动力学 一、动物细胞的增殖周期 单细胞增殖周期： 细胞间期 间期1(G1)、 DNA合成期(S期)、 间期2(G2) 细胞分裂期（M期）。 第九十九页，共一百四十九页。 M期为有丝分裂期，超螺旋化的染色单体，经过前期、中期、后期和末期，被纺锤体拉向两极，中间形成细胞板，一个细胞分裂成两个子细胞。 M期一般时间很短，为0.5～1小时。 同一类细胞的周期及其各期持续时间是一定的，但不同类型的细胞分裂周期及各期时间都不同，差异主要取决于G1期，而S和G2期相对稳定。 对连续细胞系，失去了细胞周期控制，培养条件及培养基成分会影响细胞周期。当人工培养条件不适，细胞将发生程序化死亡即凋亡过程，整个细胞分解后被膜包裹形成凋亡小体。在培养过程中，缺乏生长因子或血清、营养受限和逆境等均可引发凋亡发生。 第一百页，共一百四十九页。 二、悬浮培养细胞生长动力学 体外培养的细胞是以群体形式进行增殖和生长的，其动力学过程与单细胞微生物的生长相似。动物细胞培养的核心参数是活细胞浓度，可用细胞比生长速率（μ）、比死亡速率(Kd)和活细胞分数(fv)来描述，计算生长动力学。 第一百零一页，共一百四十九页。 1．悬浮培养细胞生长一般动力学 充分混合的悬浮培养游离细胞的反应器，假设流加操作时流出率为0，分批操作时流加率和流出率均为0，密度不变，反应器内则质量守恒： V：反应器内的培养液体积， Fi：流加新培养液的体积速度， Fo：消耗培养液的体积流速。 第一百零二页，共一百四十九页。 假定总细胞处于平衡状态： 总细胞的积累速率=细胞的流加速率－细胞的流出速率＋细胞生长速率－细胞裂解速率。在不进料情况下，总细胞平衡： N：细胞总浓度， uap：表观比生长速率，包括细胞的生长和死亡。 第一百零三页，共一百四十九页。 只有活细胞才能分裂，并假定活细胞不发生死亡： μ为真实比生长速率;Nv为活细胞浓度; Nd为死 细胞浓度;kl为死细胞比裂解速率。 活细胞占主导，死细胞裂解可忽略，即k l ＝0，那么 第一百零四页，共一百四十九页。 当活细胞转变为死细胞时，没有直接改变细胞的总浓度，那么活细胞处于平衡： μ