基因工程重组体克隆的筛选与鉴定.pptVIP

第三十一页，共五十七页。 对于能够分泌表达产物的重组体克隆，可以省去影印平板、裂解菌落等程序，操作更为简化。例如分泌胰岛素重组体克隆的筛选： 第三十二页，共五十七页。 第三十三页，共五十七页。 在放射免疫分析法基础上，最近又发展了一类非放射性免疫分析技术，例如荧光免疫分析、酶免疫分析以及化学发光免疫分析等。这些方法具有和放射免疫法相同的灵敏度和特异性，而且没有象同位素那样的半衰期短和安全防护问题，是一类很有发展前途的检测技术。 第三十四页，共五十七页。 6.3.2 免疫沉淀测定法 相对于放射性免疫法，该方法灵敏度要低，而且易受干扰，但它的价值在于实验简便易行。其做法是：在生长菌落的琼脂培养基中，加入专门抗这种蛋白质分子的特异性抗体。如果有些菌落的细菌会分泌出某种蛋白质，那么在它的周围就会出现一条叫做沉淀素的抗体-抗原沉淀物所形成的白色的圆圈。 第三十五页，共五十七页。 第三十六页，共五十七页。 上述方法的缺点是只能检测分泌出细胞的蛋白质；经两项轻微的改良后，也可以用来检测非分泌的蛋白质。 第一种改良方法是：采用对? cI857噬菌体溶源性的大肠杆菌细胞作寄主，它含有在42℃下会发生热失活的热敏感阻遏物。把生长着待检测菌落的原培养基平板，影印到加有抗体的琼脂平板上，等到影印平板中的菌落长到肉眼可以辨认的大小时，将培养温度上升到42℃，经过1 h之后，平板中就会有许多细胞被热诱导发生溶菌作用。于是细胞的内含物便被释放出来，分布在周围的培养基中，其中目的基因编码的蛋白质就会同加在培养基中的抗体发生反应，并在菌落的周围形成一圈沉淀素带。 第三十七页，共五十七页。 第二种改良方法是：将补加有抗体和溶菌酶的琼脂，小心地倾注到菌落的上面，并使之凝固。在溶菌酶的作用下，处于菌落表面的细胞发生溶菌反应，逐步地释放出细胞内部的蛋白质。如果有某些菌落的细胞能够分泌出目的基因编码的蛋白质，它们就会同包含在琼脂培养基中的抗体发生反应，形成沉淀素圈。 第三十八页，共五十七页。 6.4 转译筛选法 转译筛选法可分为杂交阻断转译法（HART）和杂交释放转译法（HRT）两种不同的筛选策略。它们的突出优点是，能够将克隆的DNA同所编码的蛋白质产物之间的关系对应起来。这两种方法都要通过无细胞转译系统检测经处理后的mRNA的生物学功能，常用的有麦胚提取物系统、网织红细胞提取物系统。 第三十九页，共五十七页。 6.4.1 杂交阻断转译法（HART） 这种方法又称杂交抑制的转译筛选法，其依据的原理是：在体外无细胞的转译体系中，mRNA一旦同DNA分子杂交之后，就不能够再指导蛋白质多肽的合成，即mRNA的转译被抑制了。 在高浓度甲酰胺溶液的条件下（这种溶液既有利于DNA-RNA的杂交，同时又能抑制质粒DNA的再联合），将从转化的大肠杆菌菌落群体或噬菌体群体中制备来的带有目的基因的重组质粒DNA，变性后同未分部的总mRNA进行杂交。 第四十页，共五十七页。 第六章 重组体克隆的 筛选与鉴定 第一页，共五十七页。 由DNA分子的体外重组，通过转化、转染、转导等适当途径引入宿主，会得到大量的重组体细胞或噬菌体。在这些众多的重组体中，会有多种类型的DNA分子，包括：不带任何外源DNA插入片段，仅由线性载体分子自身连接形成的环状DNA分子；由一个载体分子和一个或数个外源DNA片段构成的重组体DNA分子；单纯由数个外源DNA片段彼此连接形成的多聚DNA分子。 第二页，共五十七页。 对于这些由混合的DNA制剂转化而来的大量的克隆群体，需要采用特殊的方法，才能选择和鉴定出可能含有目的基因的重组体克隆。目前已发展和应用了一系列重组体克隆检测法，包括遗传检测法、物理检测法、使用特异性探针的核酸杂交法，以及免疫化学法等。 第三页，共五十七页。 6.1 利用表型特征选择（遗传检测法） 表型是指机体遗传组成同环境相互作用所产生的外观或其他特征。这里所说的供筛选用的表型特征来自两个方面：一个是克隆载体提供的，另一方面是插入的外源DNA序列提供的，前者应用较多。 第四页，共五十七页。 6.1.1 利用载体提供的表型特征选择重组体分子 1. 抗药性标记插入失活选择法 检测外源DNA插入作用的一种通用的方法是插入失活效应。例如在pBR322质粒的DNA序列上，编码有四环素抗性基因(Tetr)和氨苄