化学分离工程课件-蛋白质沉淀法.pptVIP

* 蛋白质沉淀法 1、概述 2、蛋白质溶解 3、蛋白质溶液的稳定因素 4、蛋白质沉淀方法分类 5、盐析法 6、|pH水 – pI| Value调节法 7、有机溶剂沉淀法 8、亲水聚合物沉淀法 9、沉淀动力学 10、Applications 1 概述 定义 常用加入试剂的方法，改变溶剂和溶质的能量平衡来降低其溶解度，使产物离开溶液生成不溶性颗粒，沉降析出。沉淀具有浓缩与分离的双重作用。 与结晶联系 在本质上都是新相析出的过程，主要是物理变化，当然也存在化学反应的沉淀或结晶。 区别 结晶为同类分子或离子以有规则排列形式析出，沉淀为同类分子或离子以无规排列形式析出。 1 概述 优点 A、设备简单、成本低、放大容易，产物浓度越高沉淀越有利，收率越高； B、原料液体积很快地减小10~50倍，从而简化生产工艺、降低生产费用； C、使中间产物保持在一个中性温和的环境； D、及早地将目标pro.从其pro.水解酶分离出来，避免pro降解，提高产物稳定性； E、用沉淀法作为pro色谱分离前处理，可使使用色谱分离的限制因素降低到最少。 缺点： A、沉淀物可聚集有多种物质，如大量盐类和溶剂，所以沉淀法所产品纯度通常都比结晶法低； B、过滤较困难 2 蛋白质溶解 蛋白质溶解：相似者相溶 aa的亲水性和疏水性： 有利因素：亲水性，包括氢键、极性基团、离子化侧链、亲水aa所占的%等。如白蛋白 不利因素：疏水性，包括暴露的疏水基团、疏水aa所占的%等。如纤维蛋白原。 1)、水化层(hydration shell) tight hydration shell(0.35g water/1g pro) loose hydration shell(2g water /1g pro) 2)、静电排斥 ? zeta电势 Nernst Potential—胶核表面电位(不可测) Stern Potential—(不可测) ? Potential—滑面电位(可测,mobility) ?电位 Nernst电位 ionic strength 3)、|pH水 – pI| Value |pH水 – pI| Value? zeta电势? 水化层? 静电排斥? Tight hydration shell Protein core Loose hydration shell 4 蛋白质沉淀方法分类 1）、盐析法 2）、有机溶剂沉淀法 3）、 |pH水 – pI| Value调节法 4）、亲水聚合物沉淀法 5）、聚电解质絮凝法 6）、高价金属离子沉淀法 7）、亲和沉淀法 5 盐析法 机理：A、?zeta potential；B、?hydration shell 5 盐析法 计算: Cohnx经验公式 式中, S为蛋白质的溶解度(g/L)；I为离子强度；m为盐的摩尔浓度；β值为蛋白质在纯水中(I=0时)的假想溶解度对数值，是pH值和温度的函数，在蛋白质pI时最小；Ks为盐析常数，与温度和pH值无关。 5 盐析法 方法: A、 “Ks”分级盐析法：在一定pH值及温度下，改变盐浓度（即I）达到沉淀的目的。 B、“β”分级盐析法：在一定I下，改变溶液的pH值及温度达到沉淀的目的。 C、应用：一般的初步分离用第一种方法，进一步纯化时用第二种方法。 5 盐析法 影响因素 A、无机盐种类 感胶离子序(Hofmeister序列): In 1888，Hofmeister对一系列盐沉淀蛋白质的能力进行了测定研究。 阴离子排序为：柠檬酸根3- 酒石酸根3- F- IO-3 H2PO-4 SO-4 CH3COO- Cl- ClO-3 Br- NO-3 ClO-4 I- CNS-; 对阳离子排序为： Th4+ Al3+ H+ Ba2+ Sr2+ Ca2+ Cs+ Rb+ NH4+ K+ Na+ Li+ 如何设计实验？ 结论？ 5 盐析法 结论： a 不同种类的盐主要影响Ks； b 离子半径小，带电多，电荷密度高，盐析效果好。 无机盐的挑选原则： a 较高的盐析效能； b 高溶解度，能配置高离子强度的盐溶液； c 溶解度受温度的影响小； d 盐溶液的密度不高，便于蛋白质沉淀和离心分离； e 不易引起蛋白质的变性； f 价格低廉； 最常用(NH4)2SO4。优点：符合上述要求；缺点：水解后溶液pH降低，在高 pH下产氨，腐蚀性强，有异味，有毒，终产物必须除尽。