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. 2021/7/26 * (最新整理)CHO细胞表达抗体(1) 2021/7/26 * CHO细胞表达抗体 2021/7/26 * 基因工程抗体表达体系 CHO 细胞 骨髓瘤细胞 2021/7/26 * CHO（Chinese hamster ocary） CHO细胞生物技术产业化的首选细胞系 目前70%以上的治疗性抗体蛋白都是由CHO细胞产生的 对蛋白质进行糖基化，其糖型与人类基本一致 不易传播人类病毒，比其他哺乳细胞基因组更容易进行改造和扩增 遗传背景清楚、转染效率高、可长期稳定传代并稳定表达有功能活性抗体 利于抗体纯化：非分泌型细胞，本身很少分泌内源性蛋白；可用无血清培养 2021/7/26 * CHO Classification 补充： 1980年CHO-K1经化学突变得到CHO-DXB11 （一个等位基因缺失） 1983年的电离辐射经诱变株CHO-DG44 （两个等位基因缺失） 由于CHO-DXB11 DHFR缺陷不彻底，很快被完全无DHFR活性 的CHO-DG44取代 注释： ATCC （American Type Culture Collection） 美国菌种保藏中心 ECACC（ European Collection of Authenticated Cell Cultures） 欧洲细胞株/微生物保藏中心 2021/7/26 * DHFR缺陷型宿主细胞 野生型宿主细胞 DG44 DUXB11 CHO-K1 CHO-S PcDNA3.3/Poptivec 载体系统 Life Technology公司 GS基因表达系统 瑞士的Lonza公司 DHFR基因表达系统 Life Technology公司 Freedom CHO-S Kit 宿主细胞：DG44 质粒：共转染PcDNA3.3（Neo抗 性基因，￥2000）和Poptivec（DHFR标记基因，￥3500） 筛选试剂：G418（遗传霉素）/MTX （氨甲喋呤） 宿主细胞：CHO-K1SV 质粒：PEE12.4（Amp抗性，GS标记基因，￥2000） 筛选试剂：MSX（氨基亚砜蛋氨酸） 宿主细胞：CHO-s? Cells (cGMP-banked) 质粒：pCHO1.0（嘌呤霉素和DHFR标记基因，￥10000） 筛选试剂：Puromycin/MTX（氨甲喋呤） CHO Cell 2021/7/26 * 抗体真核高效表达策略 作用环节 相应策略 整合位点 弱化选择标致基因；染色体定位筛选 基因剂量 弱化的可扩增选择标志基因 转录 强启动子、增强子、强转录终止信号、适宜的抗体基因结构 翻译 翻译型增强子，适宜的抗体基因结构 加工组装 轻重链表达平衡，宿主细胞修饰 分泌 适宜的抗体分泌前导肽，适宜的抗体基因结构 其他 选择适宜的宿主细胞、宿主细胞修饰，尽量去除非生产性克隆 抗体mRNA的转录、转录效率与mRNA的稳定性是其中最重要的因素 因此，抗体的表达量很大程度上由质粒载体的各表达调控元件及组织方式决定 2021/7/26 * CHO表达载体组成 表达载体结构组成 骨架序列 选择性标志基因 表达盒 特殊的调控序列 2021/7/26 * 选择标志基因 当环境中存在高浓度（MTX 、MSX）时，标记基因可自发在染色体上扩增拷贝数，连带其上下游的序列一起扩增，共扩增序列可达上千个bp，拷贝数可增加几百到几千倍。 对目的基因的拷贝数没有影响，如主要用于构建瞬时表达载体。 2021/7/26 * 表达盒 抗体基因表达盒的组织形式已较为固定，但其中各元件的选择仍有值得探讨的地方 启动子和相应的增强子是最关键的元件 真核启动子含有TATA盒（确定转录起始位点）和下游富含GC的序列（决定转录起始频率） 常用的CHO细胞表达启动子的转录活性依次为CMV启动子 SV40 启动子 LTR启动子 2021/7/26 * 常用的较早的商业化载体系统 适用于DHFR缺陷细胞，但是有报道CHO（DHFR-)细胞，很难驯化，生长也不好。 DHFR系统表达水平虽较GS系统低，但细胞生长稳定 新近发展的更有效的系统 具有更高的扩增效率，但细胞长期连续培养时，生长状况不佳。 2021/7/26 * PcDNA3.3/Poptivec载体系统 将右图质粒共转染CHO（DHFR-） 宿主菌须在含有GHT（甘氨酸、次黄嘌呤、胸腺嘧啶）的培养基中生长 重组质粒Poptivec-target整合到宿主菌