琼脂糖凝胶电泳注意事项PPT课件.ppt

（DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向正极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的DNA分子的迁移速度不同。如环形DNA分子样品，其中有三种构型的分子：共价闭合环状的超螺旋分子（cccDNA）、开环分子(ocDNA)、和线形DNA分子(IDNA)。这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为:cccDNA＞IDNA＞ocDNA * * （凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。分离小于0.5kb的DNA片段所需胶浓度是1.2-1.5%,分离大于10kb 的DNA分子所需胶浓度为0.3-0.7%, DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。） * * loading buffer loading buffer 的中文名字叫上样缓冲液,6*的缓冲液中可以显示两条带，前面的蓝色的条带是溴酚蓝，代表的片段大小是 300bp，后面的有点绿色的条带是二甲苯青，代表的片段大小在4000bp左右。 loading buffer的功能主要有两个。第一，显示电泳的进程，以便我们适时终止电泳；第二，加大样品密度，使样品密度大于TAE，从而沉降到点样孔中，防止样品飘出点样孔。 n×loading buffer的意义就是当将loading buffer和样品混合之后，相当于把该loading buffer稀释了n倍，比如说你用1ul 6×loading buffer的话，就应该加5ul的样品，1/（1+5）=1/6，这些只是理论上的一些数值，有时候样品的量多一些或者少一些，对结果并不会有什么影响。 * * 溴酚兰在0.5%～1.4%的琼脂糖凝胶中的泳动速度大约相当于300bp的线性DNA的泳动速度，而二甲苯青FF的泳动速度相当于4Kb的双链线形DNA的泳动速度。 电场强度愈大，带点颗粒的泳动越快。但凝胶的有效分离范围随着电压增大而减小，所以电泳时一般采用低电压，不超过4V/cm。而对于大片段电泳，甚至用0.5-1.0V/cm电泳过夜。进行高压电泳时，只能使用聚丙烯酰胺凝胶。） * 254nm的紫外线照射时，灵敏度最高，但对DNA损伤严重；360nm紫外线照射时，虽然灵敏度较低，但对DNA损伤小，所以适合对DNA样品的观察和回收等操作。300nm紫外线照射的灵敏度较高，且对DNA损伤不是很大，所以也比较适用。 * 穿插PPT * 琼脂糖凝胶电泳操作及其注意事项 欢迎大家一起交流！ ?什么是电泳？ 带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动，称为电泳。 生物大分子如蛋白质,核酸,多糖等大多都有阳离子和阴离子基团,称为两性离子在电场中,带电颗粒向正极或负极迁移,迁移的方向取决于它们带电的符号。 按分离原理的不同，电泳分为4类: 移动界面电泳 区带电泳 等电聚焦电泳 等速电泳 ?电泳有几类？ 琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法，以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。 ?琼脂糖凝胶电泳原理 备注有具体讲解 ?琼脂糖凝胶电泳的操作 操作步骤 配胶 点样 电泳 成像拍照 EB染色 胶图分析 到实验室拍几张具体的照片，每个步骤都要 1、配胶 按所要分离的DNA分子的大小，称取适量的琼脂糖粉末，放入锥形瓶，加适量1×TAE电泳缓冲液; 然后置微波炉内加热摇匀至完全溶化呈透明状，适当冷却后倒入胶托; 胶完全冷凝后放入电泳槽，电泳槽里的缓冲液必须没过胶面。 2、点样！ 根据样品不同可分两种点样体系： A、样品+6Xloading buffer B、样品可直接点样（如ssp） 最后记得点marker，并摆正胶的位置 点样 3、电泳！ 点完样后连接电源，设置好电源的参数，开始电泳。当溴酚兰的带（蓝色）的移动至一定长度即可停止电泳。 电压要求：≤20V/CM胶，在样品出孔用低压（3