DNA重组技术的基本工具(上课用)1课件.pptxVIP

专题1 基因工程普通棉花　　抗虫棉苏云金芽孢杆菌含有一种可以合成毒蛋白的基因。　　让细菌的毒蛋白基因在棉花细胞中表达，可培育出抵抗棉铃虫害的抗虫棉。提取目的基因基因表达载体的构建目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定1.1 DNA重组技术的基本工具基本工具：限制性核酸内切酶——“分子手术刀”DNA连接酶——“分子缝合针”基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”（一）限制性核酸内切酶——“分子手术刀”①来源：主要从原核生物中分离纯化出来。②种类：已从近300种微生物中分离出4000种限制酶。③作用：1.能识别双链DNA的某种特定核苷酸序列2.使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。磷酸二酯键：51432 T51423 A磷酸二酯键④作用特点：具有特异性。一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子，⑤限制酶的识别序列：大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成少数的识别序列由4、5或8个核苷酸组成EcoRI限制酶的切割： 大肠杆菌的一种限制酶(EcoRⅠ)只能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。在G与A之间切割黏性末端黏性末端什么叫黏性末端？ 被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。C C C G G GG G G C C CC C CG G GG G GC C CSmaI限制酶的切割：只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。中轴线平末端平末端⑥限制酶的作用结果：产生黏性末端或平末端。思考?如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？ 会产生相同的黏性(平)末端，然后让两者的黏性(平)末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。（二）“分子缝合针”——DNA连接酶1、种类：⑴ E·coli DNA连接酶⑵ T4 DNA连接酶2、作用：E·coli DNA连接酶或T4DNA连接酶 可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键　T4 DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低③类型：功能类型来源相同点差别E·coliDNA连接酶大肠杆菌只能连接黏性末端恢复磷酸二酯键能连接黏性末端和平末端(效率较低)T4DNA连接酶T4噬菌体(三)基因进入受体细胞的载体 ——“分子运输车”①载体的作用：将外源基因送入受体细胞。②载体的种类：质粒λ噬菌体的衍生物动植物病毒等③作为载体的必要条件：1.能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。2.具多个限制酶切点，以便与外源基因连接。3.具有某些标记基因，便于进行筛选。4.对受体细胞无害、容易提取 质粒： 裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体（即拟核DNA）之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。质粒：有切割位点有标记基因的存在，可用含氨苄青霉素的培养基鉴别。能复制并带着插入的目的基因一起复制限制性内切酶与DNA解旋酶的区别限制酶DNA解旋酶区别切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯键将DNA两条链的氢键打开形成两条单链限制性内切酶与DNA水解酶的区别限制酶DNA水解酶区别切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯键，形成片段的DNA.切割磷酸二酯键，形成单个的脱氧核苷酸。比较：DNA连接酶与DNA聚合酶DNA聚合酶DNA连接酶区别1区别2相同点1)只能将单个核苷酸连接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键1)在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键2)以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键连接成一条互补的DNA链2)将DNA双链上的两个缺口同时连接起来，不需要模板形成磷酸二酯键不是一回事。相同点：形成磷酸二酯键不同点：1）DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键2） DNA聚合酶需要以一条DNA链为模板；而DNA连接酶不需要模板。练习D1）不属于质粒被选为基因载体的理由是（ ） A、能复制 B、有多个限制酶切点 C、具有标记基因 D、它是环状DNAC2）有关基因工程的叙述中，正确的是（ ） A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列 B、质粒是基因工程中唯一的载体 C、载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与目的基因连接 D、DNA连接酶使黏性末端的碱基之间形成氢键3.下列四条DNA分子，彼此间具有粘性末端的一组是 A．①② B．②③ C．③④ D．②④答案：D４、关于限制酶的说法中，正确的是（ ）A、限制酶是一种酶，只识别GAATTC碱基序列B、EcoRI切割的是G—A之间的氢键C．限制酶一般不切割自身的DNA分子，只切割外源DNAD．限制酶只存在于原核生物中答案：C