木薯杂交种子幼胚挽救技术规程.pdfVIP

T/GACIXXXX—XXXX 木薯杂交种子幼胚挽救技术规程 1 范围 本文件规定了木薯 （Manihot esculentaCrantz）体细胞的有关定义、分类分级标准、繁育技术和保 存的规范，适用于木薯离体器官发生的分子机理研究，建立遗传转化体系，开展分子育种技术应用的要 求。 本文件适用于木薯杂交种子幼胚挽救、体细胞繁育与杂交育种。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本 （包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 28096 木薯细菌性萎蔫病菌检疫鉴定方法 GB/T 36808 木薯细菌性叶斑病菌检疫鉴定方法 NY/T 3005 植物品种的特异性、一致性和稳定性测试指南 （木薯） NY/T 2446 热带作物品种区域性试验技术规程 NY/T 2669 热带作物品种审定规范 （木薯） NY/T 1943 木薯种质资源描述规范 NY/T 1685 木薯生产良好操作规范 （GAP） SN/T 1616 非洲木薯花叶病毒检测方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 离体组织 木薯成熟植株的茎尖 （或腋芽）分生组织先端的原始细胞。 3.2 膨大组织 木薯无菌离体组织接种到诱导培养基上，细胞迅速生长、增殖变大，组织部位开始膨大，出现绿色 突起，促进组织分化、生长。 3.3 体细胞胚胎 木薯离体组织在特定培养条件下，形成的胚的类似物，经过球形胚、心形胚等发育过程。 3.4 胚性愈伤 木薯诱导的体细胞组织质地较坚实，颜色有乳白色或黄色，表面具球形颗粒，其生长缓慢。 3.5 非胚性愈伤 3.4描述除外的愈伤。 3.6 繁育 木薯愈伤组织在特定的培养条件下，将初生胚状体分离、继代培养，诱导次生胚状体发生和增殖， 进而诱导器官成熟与萌发。 1 T/GACIXXXX—XXXX 4 产地环境 4.1 材料 取不同成熟阶段的种子材料： （1）未成熟种子子叶 （a1）、胚芽 （b1）； （2）成熟种子子叶 （a2）、胚芽 （b2）； （3）诱导萌发种子子叶 （a3）、胚芽 （b3）、胚轴 （c3）。 4.2 培养基质制备 4.2.1 M1：MS （含维生素）（MurashigeandSkoog，1962）+2.00MCuSO+2.00％蔗糖+0.30％Gelrite，4 PH5.8，灭菌； 4.2.2 M2：M1+10.00 mg/L BAP，PH5.8，灭菌； 4.2.3 M3：M1+4.00 mg/L 2，4-D或12.00 mg/L Picloram，PH5.8，灭菌； 4.2.4 M4：M1+0.10 mg/L BAP，1.00 mg/L NAA或0.05 mg/L BAP+0.50 mg/L NAA，PH5.8，灭菌； 4.2.5 M5：M1+0.10 mg/L BAP +0.50 mg/L IBA，PH5.8，灭菌； 4.2.6 M6：M1+0.40 mg/L BAP，PH5.8，灭菌。 4.3 消毒处理 将木薯种子用ddHO冲洗30 s，2次；无水乙醇浸泡冲洗10 s；ddHO冲洗30 s，2次；0.1％升汞浸泡2 2 冲洗1次： （1）未成熟/成熟种子，2.0 min， （2）诱导萌发种子，60 s；ddHO冲洗30 s，2次；75％乙醇浸泡冲洗20 s，2次；ddHO浸泡冲洗2 2 30 s，2次；无菌滤纸吸干。将已经消毒材料在无菌条件下，解剖、切取2.0 mm～3.0 mm外植体材料： 子叶 （a）、胚芽 （b）和胚轴 （c），置于M1培养基上保湿、培养，备用。 4.4 膨大诱导处理 将外植体置于M1上进行预培养处理3d，以无预培养材料为CK，然后转移置于诱导膨大培养基M2上， 26.00°C