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T/GACIXXXX—XXXX 木薯原生质体再生植株技术规程 1 范围 本文件属于木薯组织培养再生技术。本文件规定了诱导木薯脆性胚性愈伤组织 （FEC）、原生质体 制备、原生质体培养、愈伤组织悬浮培养、体细胞胚胎诱导、胚胎再生植株的实验方法和步骤。 本文件适用于木薯胚性愈伤组织的诱导与离体培养、原生质体培养、木薯遗传转化以及细胞融合再 生等生物技术领域。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本 （包括所有的修改单）适用于本 文件。 NY/T 1520 木薯 DB33/T 752 植物种苗组培快繁技术规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 植物细胞全能性 指植物的每个细胞都包含着该物种的全部遗传信息，从而具备发育成完整植株的遗传能力。在适宜 条件下，任何一个细胞都可以发育成一个新个体。 原生质体 指去掉细胞壁的裸露的有活性的细胞。 4 缩略词 FEC：脆性胚性愈伤组织 CIM：诱导胚胎培养基，适用于芽、嫩叶等外植体 MSN：诱导胚胎培养基，适用于胚性愈伤组织 GD：胚性愈伤组织的维持和增殖培养基 SH：悬浮培养基，胚性愈伤组织的维持和增殖 TM2G：培养原生质体的培养基 CMM：胚状体成熟培养基 CEM：生芽伸长培养基 MS：生根和组培苗继代培养基 2,4-D：2,4一二氯苯氧乙酸 6-BA：6-苄基腺嘌呤 NAA：萘乙酸 ZT：玉米素 1 T/GACIXXXX—XXXX 5 原理 木薯外植体在含特定激素的培养基上能诱导胚性愈伤组织，再用胚性愈伤组织分离原生质体，利用 植物细胞的全能性，木薯原生质体能分裂增长成胚性愈伤组织，然后分化成胚状体长成完整植株。整个 过程是：外植体→胚性愈伤组织→原生质体→胚性愈伤组织→胚状体→完整植株。 6 培养基配方及溶液配制 见附录A、B、C、D。 7 操作步骤 诱导胚性愈伤组织 7.1.1 诱导循环胚胎 将组培苗外植体 （嫩叶、芽等）在含12 mg/L Picloram的CIM培养基中诱导初生胚胎，每2w换一次 培养基，将产生的初生胚胎用镊子挑出，继续在CIM培养基上培养2～4m，诱导循环胚胎。 7.1.2 诱导胚性愈伤组织 诱导的循环胚胎，放在GD培养基上培养1～2m，将循环胚胎表面产生的细小颗粒分离，再在GD培养 基上增值培养，不断循环，形成脆性胚性愈伤组织 （FEC）。 建立悬浮系+ 取脆性胚性愈伤组织约1 g，转移至约30 mL SH液体培养基中，置于摇床，于25°C，光照强度 800～1000 lx，转速110～130r/min下震荡悬浮培养。每隔2～3d继代1次，继代5～15d后使用。 分离纯化原生质体 7.3.1 酶解 取继代5～15d的愈伤组织悬浮系，用镊子除去大颗粒，吸管吸除液体培养基，称取1g组织，用约 12 mL酶液酶解。酶液由10 g/L纤维素酶，0.4 g/L离析酶，0.1 g/L果胶酶，368 mg/L CaCl，34 mg/L2 KHPO ，740 mg/L KNO，492 mg/L MgSO·7HO，19.2 mg/L Na-EDTA，14 mg/L FeSO·7HO，91 g/L甘露 2 4 3 4 2 4 2 醇，0.5g/LMES，1 mg/LNAA，1 mg/L 2,4-D 组成。在25°C、40r/min、黑暗条件下酶解18 h。 7.3.2 纯化 采用梯度离心法。将酶解好的组织经45 μm不锈钢网筛过滤，可能是由于液体表面张力的作用，酶 液很难自动流下，一般需要很久，这时给不锈钢筛网一个外力，酶液很快就流下过滤了。滤液转入1