基于气体报告的汞全细胞生物传感体系的构建、优化及检测的应用研究.pdfVIP

摘 要 汞是环境中常见的污染性重金属，常规大型仪器检测方法很难实现汞污染的现场 检测和实时监测。然而快速检测技术的发展有效弥补了传统检测技术的局限性，特别 是全细胞生物传感器能以活体细胞为分子识别体系，快速、灵敏地响应靶标物质。全 细胞生物传感器主要由两个部分组成，分别是感应元件和报告元件。感应元件即转录 调节因子，能够响应靶标物质或其浓度变化；报告元件即人类或已有仪器可识别信号 的元件，通常为可视化蛋白质、功能核酸等。荧光蛋白作为常见的光学报告元件，广 泛用于全细胞生物传感器的构建。然而光学方法具有局限性，不能有效反映不透明介 质的汞离子浓度，例如土壤、污水等。为解决这一瓶颈问题，本研究基于乙烯形成酶 （EFE ）和转录调节蛋白（MerR ）构建了一种利用气体作为报告信号的全细胞生物传 感体系，可在现场灵敏、快速地检测土壤汞含量。其主要涉及气体报告全细胞生物传 感体系的基本构建、条件优化与验证，在土壤中实际检测的开发与应用。 首先，本研究选取乙烯形成酶基因（efe ）作为报告基因，通过表达的EFE 分解 底物产生乙烯（C H ）构建了诱导型气体报告全细胞生物传感器，并对其产C H 量 2 4 2 4 进行优化。该生物传感器经诱导可成功产生 C H ，有效将汞离子浓度转化成气体浓 2 4 度信号输出。通过对诱导时间、生长方式、底物条件优化，探究到生长至 OD600 0.8 的生物传感器添加了100 μL 的100 μM 葡萄糖和α-酮戊二酸后，可在45 min 检测到 最高C H 浓度；同时对全细胞生物传感器的灵敏度、特异性进行探究与验证，证明 2 4 该生物传感器不受样品中其他金属离子影响，可有效反映1-500 μM 汞离子浓度范围， 为后续的实验进展奠定基础。 其次，开发并验证了检测土壤汞的气体报告诱导型/组成型 MerR （479-iMerR- EFE/479-cMerR-23119-EFE ，iMerR/cMerR ）全细胞生物传感体系的可行性与安全性， 并研发了冻干iMerR/cMerR 制品，可便携、稳定、有效地监测土壤汞污染扩散状态。 结果表明该体系处理土壤样品方法简便，可适应复杂的土壤环境，有效反映出不同质 地土壤的汞污染状况，同时在不同pH 值 （5.5-8.5 ）、渗透压 （0.6-1.2% ）条件的土壤 中稳定表达，有效消除土壤其他成分对生物传感细胞活性的影响，提高其抗干扰能力， 同时具备良好稳定遗传性与环境安全性。开发的冻干状态体系能够在储藏 30 d 后良 好反映土壤中汞离子的含量，实现现场土壤汞离子污染监测工作，落实应用落地，形 成汞污染检测工作流。 综上所述，本研究成功构建了土壤中有效检测汞含量的气体报告全细胞生物传感 体系，能够将汞离子浓度转换为C H 气体信号定量输出。开发了便携、稳定、灵敏、 2 4 安全的可推广多检测环境的冻干合成生物学微生物体系，能够在45 min 内检测土壤 中0.2-20 mg/kg 的汞离子浓度，有效反映土壤中的汞污染是否超标，为现场监测汞污 I 染提供了一种简单、廉价、安全且便携性的方法，为合成生物学在全细胞生物传感器 遗传电路的设计提供新思路。 关键词：生物传感器，汞，大肠杆菌，乙烯，土壤，合成生物学 II Abstract Mercury is a common polluting heavy metal in the environment, which is difficult to achieve on-site detect