阿维链霉菌中转录调控因子Rok7B7和HspR的调控功能及其作用机制.pdfVIP

摘 要 重要工业微生物阿维链霉菌 (Streptomyces avermitilis) 因其能够发酵产生高效、 低毒的广谱杀虫抗生素阿维菌素 (Avermectins) 而闻名。为了进一步阐明阿维菌素生 物合成的调控机制, 本工作对阿维链霉菌中ROK 家族调控因子Rok7B7 和热激胁迫 响应调控因子HspR 的调控功能和作用机制进行了深入研究。 rok7B7 (sav_2248) 编码ROK 家族的调控因子Rok7B7 。通过对rok7B7 缺失、回 补和过表达, 并进行摇瓶发酵、表型观察以及扫描电镜实验, 初步证实 Rok7B7 抑制 阿维菌素的合成、促进寡霉素 A 的合成、抑制阿维链霉菌的形态分化以及木糖和葡 萄糖的利用。EMSA 、BLI 、ChIP-qPCR 和RT-qPCR 实验证实, Rok7B7 通过直接抑制 阿维菌素生物合成结构基因 aveA1 、aveA2 的转录, 直接激活寡霉素生物合成途径特 异性正调控基因 olmRI 的转录, 从而调控阿维菌素和寡霉素的合成。Rok7B7 还通过 直接抑制木糖转运操纵子xylFGH 的转录影响木糖利用。xylFGH 操纵子的表达受木 糖诱导、葡萄糖抑制。木糖和葡萄糖都可作为Rok7B7 的配体, 但它们对Rok7B7 与 xylFGH 启动子区结合活性的影响是相反的。葡萄糖介导的碳代谢阻遏对木糖转运操 纵子xylFGH 的抑制作用依赖于Rok7B7, 缺失rok7B7 可解除葡萄糖对xylFGH 的抑 制作用, 提高木糖和葡萄糖的共利用效率。对Rok7B7 在aveA1p 、olmRIp 和xylFp 上 的结合序列进行分析, 发现了一段保守的 13-bp 结合位点 5′-TTKAMKHSTTSAV-3′, 利用该序列预测了275 个Rok7B7 靶基因, 并验证了 11 个新的参与形态分化、次级 代谢、葡萄糖利用和初级代谢的靶基因。因此, Rok7B7 作为一个重要的全局调控因子, 协同调控阿维链霉菌的多种重要生理过程。 hspR (sav_4487) 编码响应热激胁迫的调控蛋白HspR 。通过对hspR 缺失、回补 和过表达, 并进行摇瓶发酵、表型观察、扫描电镜、热激胁迫和H O 胁迫实验, 初步 2 2 证实 HspR 促进阿维菌素的合成, 抑制阿维链霉菌的形态分化, 响应热激和 H O 胁 2 2 迫。EMSA 、ChIP-qPCR 和RT-qPCR 实验证实HspR 直接激活阿维菌素合成结构基因 aveA1 、aveA2, H O 胁迫相关基因katA1 、catR、katA3 、oxyR、 ahpC 、ahpD 的转录; 2 2 直接抑制热激胁迫基因clpB1、clpB2、lonA 和dnaK1-grpE1-dnaJ1-hspR 操纵子, 形 态分化基因wblB 、 ssgY 、ftsH 的转录。HspR 可与PhoP 相互作用结合在dnaK1p, 共 同抑制dnaK1-grpE1-dnaJ1-hspR 操纵子的表达。PhoP 还直接抑制热激胁迫基因htpG 、 hsp18_1 、hsp18_2 的表达。对HspR 靶基因的启动子区进行分析, 得到了一段保守的 结合序列 5′-TTGANBBNNHNNNDSTSHN-3′, 利用该序列预测了涉及更多生理功能 的HspR 调节子。过表达 hspR 不仅可提高阿维菌素的产量, 也能提高天蓝色链霉菌 中抗生素的产量。本研究不仅揭示了 HspR 与PhoP 新的调控功能和作用机制, 而且 I 为提高链霉菌抗生素产量提供了新思路。 关键词: 阿维链霉菌, 阿维菌素, 转录调控因子, Rok7B7, HspR