转基因动物分析和总结.docxVIP

第六章 转基因动物 转基因动物是指用DNA 重组技术将人们所需要的目的基因导入动物的受精卵或早期胚胎内，使外源目的基因随细胞的分裂而增殖并在体内表达，且能稳定地遗传给后代的动物。 1982 年美国华盛顿大学 Palmiter 等将大鼠生长激素基因导入小白鼠的受精卵里，再将这一受精卵植入借腹怀孕的母鼠体内，生下一个比正常体格大一倍的“超级小鼠”。 按照转基因小鼠的思路，人们已经成功的获得了转基因大鼠、鸡、山羊、绵羊、猪、兔、牛、蛙、鱼等。 第一节 动物转基因技术 转基因动物的关键技术包括： 外源目的基因的分离 外源目的基因与转性基因表达启动子、增强子、报告基因等构件的拼接重组 重组DNA 导入生殖细胞或胚胎干细胞 胚胎移植技术 鉴定及筛选 目的基因整合率及表达效率的检测 一、显微注射法 目的基因的制备 小鼠的准备和要求 受精卵的分离 显微注射 受精卵的移植 转基因小鼠的鉴定 二、逆转录病毒法 原理： 逆转录病毒的核酸为一条单链RNA 分子，其基因由两部分组成，一是顺式作用序列， 为病毒复制和整合所必需；二是反式作用序列，编码病毒的包装蛋白。将外源基因取代反式 作用序列构建成重组载DNA。 另外将包装蛋白基因导入专门的细胞并使之整合到染色体上，形成包装细胞。 如果重组病毒 DNA 导入这种包装细胞中，病毒包装蛋白能将DNA 包装成具有感染力的重组蛋白颗粒，能浸染动物细胞而将重组DNA 引入宿主细胞。 步骤： 逆转录病毒载体的构建 选择和培养包装细胞系 重组病毒DNA 导入包装细胞 收集重组病毒颗粒 感染胚细胞，使细胞转化 此法是目前制备转基因鸡最有效和最成功的方法。 三、胚胎干细胞法 胚胎干细胞是在人（哺乳动物）胚胎发育早期——囊胚（受精后约 5—7 天）中未分化 的细胞。囊胚含有约140 个细胞，外表是一层扁平细胞，称滋养层，可发育成胚胎的支持组织如胎盘等。中心的腔称囊胚腔，腔内一侧的细胞群，称内细胞群，这些未分化的细胞可进一步分裂、分化，发育成个体。 由于内细胞群可以发育成完整的个体，因而这些细胞被认为具有全能性。当内细胞群在培养皿中培养时，我们称之为胚胎干细胞。 1．利用胚胎干细胞法制备转基因小鼠的过程 （1）3.5 天的孕鼠 分离胚细胞 转入培养皿中培养 分离内层细胞团 收集干细胞克隆 酶处理解散细胞 培养干细胞 转染干细胞 植入代孕母鼠体内 在胚胎干细胞基础上的基因打靶技术 2007 年诺贝尔生理学或医学奖分别授予两名美国人马里奥·卡佩基、奥利弗·史密斯和一名英国人马丁·埃文斯，以表彰他们在“基因靶向”技术方面的突出贡献。诺贝尔奖评审委员 会发布的公报说，三位科学家“在涉及胚胎干细胞和哺乳动物ＤＮＡ重组方面有着一系列突破性发现”，为“基因靶向”技术的发展奠定了基础。在“基因靶向”技术的帮助下，科学家可 以使小鼠体内的特定基因丧失功能。此类“基因敲除”试验可以帮助人们了解基因在胚胎发育等多种现象中发挥何种作用。“基因靶向”技术为阐明人类疾病的发生机理方面发挥了至关重要的作用 。 基因打靶是指通过DNA 定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，从而在生物活体内研究此基因的功能。 基因打靶技术是一种定向改变生物活体遗传信息的实验手段，它的产生和发展建立在胚 胎干(ES)细胞技术和同源重组技术成就的基础之上，并促进了相关技术的进一步发展。 通过对生物活体遗传信息的定向修饰包括基因灭活、点突变引入、缺失突变、外源基因定位引 入、染色体组大片段删除等，并使修饰后的遗传信息在生物活体内遗传，表达突变的性状， 从而可以研究基因功能等生命科学的重大问题，以及提供相关的疾病治疗、新药筛选评价模 型等。基因打靶技术的发展己使得对特定细胞、组织或者动物个体的遗传物质进行修饰成为 可能。 四、精子载体法 精子载体法是精子和外源 DNA 混合培养时，外源 DNA 可直接进入精子的头部，通过受精将外源基因引入动物细胞中。 外源DNA 导入精细胞的方法有DNA 与精子共育法、电穿孔导入法、脂质体转染法。 五、体细胞核移植法 1997 年，英国科学家 Schnieke 和 Wilmut 等通过体细胞核移植技术成功克隆了“多莉”。 1997 年 6 月 Wilmut 报道用胚胎细胞为核供体，获得了表达治疗人血友病的凝血因子IX 转基因克隆绵羊“波莉”。 1999 年，美国科学家 Alexander 克隆了３头山羊，改变了它们的基因性状，使它们的乳液内含有一种对心脏病具有疗效作用的蛋白质。 六、受体介导法 是将外源 DNA 与受体分子连接后与胚胎细胞共培养，受体可以介导外源DNA 进入受体细胞，从而实现基因转移。 1999 年，Ivanava 用受体介导法制作了转基因鼠