无菌操作与培养用液.pptVIP

NaHCO3 溶液（常用） 常用浓度为7.5%。配制时用三蒸水溶解后，过滤除菌或高压灭菌，分装，4℃保存(NaHCO3遇热不稳定,会分解释放出CO2) HEPES（分子量238.31）溶液 一种弱酸，中文名字是羟乙基哌秦乙硫磺酸，对细胞无毒性 防止培养基pH迅速变动。 主要作用:防止培养基pH迅速变动。在开放式培养条件下，观察细胞时培养基脱离了5%CO2的环境，CO2气体迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此时可以维持pH7.0左右。一般在进行克隆化培养时要添加HEPES 使用终浓度一般为10-50mmol/L 常配成1M 储存液：用20ml 双蒸水溶解4.76克HEPES，过滤除菌或高压灭菌，分装小瓶，4℃保存。使用时可向100ml培养液中加入2ml HEPES浓缩液，终浓度为20mmol/L 　４、抗生素液 青、链霉素的配制及使用浓度 青霉素80万U加Hank’s液至80 mL，浓度1万u/ mL 链霉素100万U（相当于1g）加Hank’s液至100 mL，浓度10mg/mL 分装后至-20℃冰箱保存 使用浓度：青霉素－ 100u/mL 　　　　　　链霉素100ug/mL 注意： 尽管很多实验室在细胞系的培养基中常规加入抗生素作继代培养，但仍建议不要在原代培养中加入抗生素。 酚红 大多数培养液中使用酚红作为pH 指示 红色表示中性pH，黄色代表酸性pH，紫色表示碱性pH 在一些特殊培养液中不含酚红 因为已有一些研究表明：酚红能模拟类固醇激素（尤其是雌激素）样作用 　　　　　　 无菌操作技术与培养用液 　 一、细胞培养操作基本要领和要求 防止污染是决定培养成败的首要条件。 培养前准备 准备各种所需物品（宁多勿 少）；用品置于场地，然后消毒 操作野消毒 现多用紫外线灯灭菌，效果很好。 洗手和着装 洗手用75%酒精或0.2%的新洁尔灭 无菌操作 培养操作 动作准确敏捷 不用手触及已消毒物品 操作面布局合理 操作保持一定顺序 组织或细胞在未做处理前或培养液在未用前，勿过早暴露在空气中；用过之后如不再重复使用，应立即封闭瓶口。 防止各种用液的交叉污染 不向操作野讲话或咳嗽 一、消毒 细胞培养的最大危险是发生培养物的细菌、真菌和病毒等微生物的污染 常见原因： 操作间或周围空间的不洁 培养器皿和培养液消毒不彻底 由于有关培养的每个环节的失误均能导致培养失败，故细胞培养的每个环节都应严格遵守操作常规，防止发生污染 消毒灭菌方法 物理消毒灭菌法 紫外线：用于空气，操作台表面和不 能使用其它法进行消毒的培养器皿。 消毒时间：30min（至少） 紫外杀菌功能除了紫外本身以外，还 可以由产生的臭氧来完成。紫外灭菌 以后，最好过一个小时再进去。 过滤：0.22μm（适用于液体） 湿热（高压蒸气灭菌法）15磅,121℃，20min 各种物品有效消毒压力和时间不同，一般要 求如下： 培养用液、橡胶制品 l0磅l0分钟 布类、玻璃制品、金属器械等 15磅20分钟 干烤：160℃, 2 小时（适用于玻璃器皿等） 注意：消毒后不要立即打开箱门，以防止冷 空气骤然进入引起玻璃炸裂，影响消毒效果。 化学消毒灭菌法 7５%酒精 主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室内的壁面处理 1－２‰新洁尔灭 主要用于器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦试消毒 抗生素 主要用于培养用液灭菌或预防培养物污染 在细胞培养中最常用的抗生素是青霉素（常用浓度是100u/ml）与链霉素（100μg/ml）。 建议不要在原代培养中加入抗生素 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 培养用液是维护组织细胞生存、生长及进 行细胞培养各项操作过程中所需的基本溶 液。 主要包括　平衡盐溶液 　　　　　　培养基 　 　　　　　　其他培养用液 　 天然培养基 合成培养基 细胞培养用液 　　第一节 水和平衡盐溶液 1、水：细胞培养用水必须非常纯净，不 　　　　　含有离子和其他的杂质。 　　需要用新鲜(一周内）的三蒸水或纯净水  2、平衡盐溶液（balanced salt solution,BSS） 　组织细胞培养中常用的基本液体，可以维持渗透压、调节pH值、供给细胞生存所需的无机离子成分；用于洗涤组织、细胞等 几种常用的平衡盐溶液：主要由无机盐、葡萄糖组成 Ringer、PBS、Tyrode、Earle、Hank’s、D-Hank’s、Dulbecco（都有相应配方） 最简单的BSS是Ringer。D-Hank’s与Hank’s的一个主要区别在于前者不含有Ca2+、Mg2+ ，因此D-Hank’s常用于配制胰酶溶液。 配制平衡盐溶液也应当用新鲜的三蒸水。配