实验四__重组蛋白的SDS-PAGE.pptVIP

1 实验目的 1.1 通过本实验学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法的基本原理。 1.2 初步掌握应用此法测定蛋白质分子量的操作技术。 纸电泳 琼脂糖电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 毛细管电泳 nativeSDSIEF2Dclassification 2 实验原理 SDS－PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）， 1967年由Shapiro等建立 1969年由Weber和Osborn进一步完善 用于测蛋白质亚基分子量 聚丙烯酰胺凝胶聚合原理及有关特性 聚合反应 聚丙烯酰胺是由单体(Acr)、交联剂(Bis)，在催化剂(AP或核黄素) 和加速剂(TEMED)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。 ①丙烯酰胺（Acr）：是凝胶的最主要成分，单体聚合形成长链。 ②甲叉双丙烯酰胺(Bis)：是交联剂，将聚丙烯酰胺链交联成三维网状结构。 ③过硫酸铵(AP)或核黄素(Vb2)：提供自由基，引发聚合反应。 ④四甲基乙二胺（TEMED）：是加速剂，它催化过硫酸铵形成自由基。 对核黄素引发的光聚合也有加速作用。 化学聚合：使用AP作催化剂，常用于制备分离胶（小孔胶）。 　过量氧会影响链的延长和聚合，所以过硫酸铵(AP)催化的化学聚合要水封以隔O2。 光聚合：使用核黄素作催化剂，聚合反应需光照， 适用于制备浓缩胶(大孔胶)。 　应控制AP和TEMED的用量，使凝胶在40min-1hr之间聚合完全为宜。 凝胶浓度与孔径的关系： T浓度大，孔径小，移动颗粒穿过网孔阻力大。 T浓度小，孔径大，移动颗粒穿过网孔阻力小。 1 样品浓缩效应 (1)凝胶孔径不连续性 (2)缓冲体系离子成分及pH值的不连续性 (3)电位梯度的不连续性 (1)凝胶孔径不连续性: 浓缩胶 T=5% 孔径大 分离胶T=7%－15% 孔径小 在2层凝胶交界处，由于凝胶孔径的不连续性使样品迁移受阻而压缩成很窄的区带。 (2)缓冲体系离子成分及pH值的不连续性: Tris: 缓冲配对离子，维持溶液的电中性及pH值 Cl-:在电场中迁移率快，前导离子(leading ion) ，快离子。 Gly:其pI =6.0，在pH6.7的浓缩胶缓冲体系中，甘氨酸解离度很小，因而在电场中迁移很慢，称为尾随离子（trailing ion），慢离子。 当进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质;因此Cl-及NH2CH2COO-沿着离子界面继续前进。蛋白质分子由于分子量大，被留在后面,然后再分成多个区带. 大多数蛋白质在pH6.7或8.3时均带负电荷，在电场中，都向正极移动。 (3)电位梯度的不连续性 V(电泳速度)=E(电位梯度) * m(迁移率) E高m慢≈E低m快 由于蛋白质的有效迁移率恰好介于快、慢离子之间，因此也就聚集在这个移动的界面附近，被浓缩形成一个狭小的中间层。 2 分子筛效应 分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率分子筛效应。 分子量小且为球形的蛋白质分子所受阻力小，移动快，走在前面;反之，则阻力大，移动慢，走在后面。 分子筛效应不同于柱层析中的分子筛效应，后者是大分子先从凝胶颗粒间的缝隙流出，小分子后流出。 3 电荷效应 进入pH8.9的分离胶中，各种蛋白质所带净电荷不同，而有不同的迁移率。 表面电荷多，则迁移快；反之，则慢 各种蛋白质按电荷多少、分子量及形状，以一定顺序排成一个个条型的区带，从而达到分离的目的。 凝胶浓度与被分离物分子量的关系： 由于凝胶浓度不同，平均孔径不同，能通过可移动颗粒的分子量也不同. SDS电泳系统中引入了SDS和还原剂，如β-巯基乙醇和二硫苏糖醇（DTT） 。 SDS 是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助溶性试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，使蛋白去折叠变性，多聚体解聚为亚基。 还原剂能断开链内和链间二硫键，使蛋白质以单链形式存在。 解聚后的氨基酸侧链与SDS充分结合形成蛋白质-SDS复合物。其形状为长椭圆棒状，短轴的长度都一样，约为18?，而长轴长度与蛋白质分子量成正比。 在一定条件下，SDS与大多数蛋白质的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质 SDS的硫酸根带负电，使各种蛋白质的SDS复合物都带上相同密度的负电荷，大大超过蛋白质分子原有的电荷，因而屏蔽了不同种类蛋白质分子之间原有的电荷差异，从而使蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关，这样便能直接从电泳迁移率计算出蛋白质的分子量。 在分子量15KD-200KD范围内，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系，即： lgMW = K- b·mR MW 为蛋白质分子量