荧光定量PCR问题疑难解答(1).pdfVIP

荧光定量 PCR 问题疑难解答（一） 两天我做标准曲线，线性关系还行，R 平方 0.998。但是扩增效率只有80%，另外扩增曲线 也不是太光滑。2.我用 SYBR 作为荧光染料，样品的荧光强度也挺低的，只有 100-200左右。 A：曲线不光滑有时跟染料的量相关，可以加大看看，或者就是扩增产物太少了。 1. PCR 反应效率差：引物，试剂PCR 条件的原因。 做 realtime-pcr 优化体系很重要，你的扩增效率低。可以增加 Mg 离子的浓度，如果其他条 件都好了，还不行，那就是引物的原因，那你就只能重新设计引物了。 2. PCR 中混入影响反应的物质： 模板提取方法需要改进 3. 样品稀释不准确： 这很重要，做标准曲线很多不好的时候，很多都是倍比稀释的问题，正常情况10倍比稀释 时，前后是相差 3.32 个循环。 Q：荧光定量PCR 的灵敏度 A：对于染料法的荧光定量来说，Ct 值在 13~30之间比较准确，30~33 之间需要再次确认， 在以上范围内的置信度比较差。 Q：标准曲线要重复两三次吗? A：没有人说做定量PCR 标准曲线要重复两三次，只是用来做标准曲线的梯度点最好不要少 于 4 个，否则标准曲线准确性不高。 Q：关于荧光定量标准曲线的制作 A：一般的仪器虽然声称能进行单拷贝检测，但如果不是特别设计的体系，很难做到100拷 贝以下的准确定量，一般用来做标准曲线的最小浓度为 1000拷贝，再往下可靠性就降低了， 这不是稀释或其他什么问题，而是本身你选作标准曲线的浓度以及定量浓度最好不要低于 1000拷贝，如果再低一点，100拷贝也勉强可以接受，否则即使你做出来，认可度也不会太 高。 Q：溶解曲线高矮 A：T 值相同，而峰高低有差异是表达丰度不同，同样的扩增产物也会出现T 值有微小差 异，一般差异在 1度以内都可以接受。融解曲线的纵坐标表示荧光信号对温度的一阶负导数。 Q：定量PCR 没有扩增 A：把定量PCR 的产物跑个电泳，看看有无产物，如果电泳有条带，说明PCR 是成功的，只 是荧光信号没有读取到，这时要调整染料或探针的浓度（看你是染料法还是探针法）；如果 电泳没有条带，那么还要在定量 PCR 仪上优化实验条件。虽然你在普通PCR 仪上优化过条件， 但换了定量 PCR 仪，由于两台仪器的升降温速度及温度精密度等指标存在差异，同样的条件 做不出 PCR 也是可能的。 由于很多因素的影响，扩增子的溶解温度会有一定变异。溶解温度会受特殊缓冲液的 pH 值， 所用 Taq 聚合酶，SG 和 MgCl2 浓度和其他因素的影响。要做溶解曲线的对比你首先要确保 所用的条件相同。 Q：SG 的稳定性如何？ A：只要不进行稀释，SG 是非常稳定的。一旦稀释，可以保存1 周到 3 个月，这取决于冻融 次数，推荐配置成一定浓度的贮存液，用时现用现配稀释液。 为优化 SG 反应，有必要在所有的常规步骤来确定，优化扩增反应的条件（合适的MgCl2、 dNTP 和 Taq 酶浓度等）。结果应该在凝胶电泳上有唯一的条带。 SG 分析的优化主要包括以下 4 个因素： a) SG 浓度 b) 引物浓度 c) MgCl2 浓度 d) 温度和反应次数 推荐的 SG 终浓度变动范围是 1：5000 到 1：100000。经常用到的浓度范围是 1：10000 到 1： 70000。引物浓度的优化应该测试不同浓度的正向和反向引物。引物浓度的范围应该是50nM 到 300nM，然而，也有例外的情况。 Q：荧光定量污染解决办法 A：几个月前我也有跟你一样的遭遇，当时跳楼的心都有。后来美国来人给培训，按照他们 的要求，污染果真就给控制了，两个月来一直还很好。以下的经验希望对你有用。 1. 配反应体系和加模板要在不同的屋子进行； 2. 配体系的屋子准备一件干净的白大衣，每次进去都要记得换白大衣，至少要把别的屋子 穿的白大衣脱掉； 3. 分装好体系以后把反应板/条放在一个有盖的干净的托盘中端到加样的房间； 4. 配体系戴的手套可以带到加样的房间，反过来不可； 5. PCR 完毕后，反应产物拿到别的屋子扔掉； 6. 最重要的就是不要把DNA 带到配体系的屋子，以上几点也都是为了这一目的。 Q：荧光定量real-timePCR 重复性问题 A：建议不要只加 1ul，而是稀释 10倍左右然后加 10ul，这样有助于改善重复性。 如果你测的是拷贝数，重复性不好是很难避免的。我感觉用SYBR green 作 realtime 的误差 还是比较大的，它的优势在于灵敏度高，但如果想精确定量，还是比较困难的，只好重复很 多次，或者多花钱买标记的引物，那个