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精品文档 自动生化分析仪实际K 值测定 实际K 值：理论K 值受样品和试剂的加量准确度、比色杯光径准确度，尤其是ε 的影响。 ε 在波长和温度等不同时有所不同，故有必要获得用户所用分析仪的实际ε ，再计算K 值， 此为~ 。 一、340nm 波长实际K 值测定 【实验原理】：通过有NAD+ （NADP+ ）参与的反应途径，用NADH 或NADPH 标准液来 校正仪器。用己糖激酶（HK ）方法测定葡萄糖时，葡萄糖的消耗与NADH 的生成呈等摩尔 关系。葡萄糖有标准纯品，当反应达到终点时，NADH 的摩尔数等于标准的葡萄糖摩尔数。 在需要校正的仪器上测其A 即可求得实际摩尔吸光系数，计算出实际K 值。 【注意事项】 1．减少偶然误差 重复测定10 次，当CV5 ％时，则重新测定10 次。 2 ．减少系统误差 使用实际K 值计算酶活性。 3 ．如果实际ε 值与理论ε 值偏差过大，需对仪器检修和校正。 二、405nm 波长实际K 值测定 【实验原理】：许多酶活性测定时，以人工“色素原”为底物，经酶作用后可释放出在405nm 波长具有吸收峰有色的反应产物，如对硝基苯酚(4-NP)、对硝基苯胺(4-NA)、对硝基-5-氨基 苯甲酸(ANBA)。他们在405nm 波长时的理论ε 分别为18 700、9 870 、9 490 。可使用其相 应的纯标准品在需要校正的仪器上测其A 即可求得实际ε ，计算出实际K 值。以ALP 实验 (产物为4-NP) 为例测定实际K 值。 【注意事项】 1．4-NP 标准品纯度要求较高，必要时需纯化。 2 ．其他注意事项参见340nm K 值校正。 三、如何校正K 值 在理论K 值或实际K 值得情况下，测定某标准品的含量，若测得的结果偏低，则需要把测 得的结果调整至原标准品的含量，此时调整的数值称为校正因子，则校正K 值=理论（实际） K 值 × 校正因子=理论（实际）K 值 × 校准值 ÷ 实测值 NADH 正负向反应测定酶活性 一、血清乳酸脱氢酶测定 LD 催化反应式为：L-乳酸 + NAD+ （LD ）→ 丙酮酸 + NADH + H+ 在反应过程中，乳酸被氧化生成丙酮酸，同时NAD+还原为NADH 。因NADH 在340nm 处 有吸收峰，反应会引起340nm 吸光度的增高。吸光度增加的速率与样本中LD 活性呈正比 关系。NADH 正向反应的最适pH 偏碱性，可使反应平衡偏向产生丙酮酸的方向。 【参考范围】成人血清LD ：109 U/L ~245 U/L 【临床意义】 1. LD 活性增高：目前临床测定LD 活性常用于心肌梗塞、肝病和恶性肿瘤的辅助诊断。 2. LD 活性降低：目前没有发现重要的临床意义。 3. LD 的特异性差，几乎存在各种组织中，如：心、肺、肾、肝、骨骼肌以及恶心肿瘤等疾 患时均致此酶增高。 【注意事项】 1. LD 活性测定可用抗凝血浆，肝素的影响不大， 而草酸盐抗凝剂、EDTA 都是LD 的竞 争性抑制剂，能抑制LD 活性。 2. 不同的LD 同工酶对温度的敏感性有差异。组织提取液若放于-20℃过夜，LD4 和LD5 会 丧失全部的 活性。 精品文档 精品文档 3. 严禁使用溶血标本，红细胞、血小板中含有大量的LD 。 4. 比色应在5~15min 内完成，否则吸光值会降低。 【评价】 LD 能可逆地催化乳酸（lactate, L）和丙酮酸（pyruvate, P ）之间的氧化还原反应。 1. 正向反应最适pH 是8.8~9.8，能使平衡偏向生成丙酮酸的方向。 其优点是乳酸和NAD+稳定性好。且NAD+纯品价格较低，过量乳酸对LD 活性的抑制较小， 反应线性较宽,重复性较好，特异性高。 缺点是需要较高的底物浓度，反应速度较慢。 2. 逆向反应的最适pH 为7.4~7.8，与生理性pH 相同。 其显著的优点是NADH 用量少，仅为正向反应的3%，且反应速度比正向快3 倍，灵敏度高。 缺点是但丙酮酸与 NADH 的稳定性较差，过量的丙酮酸对LD 活性的抑制作用较大。 二、连续监测法测定血清ALT 【实验原理】 L-丙氨酸 + α -酮戊二酸 （ALT） → α -丙酮酸 + L-谷氨酸 α -丙酮酸 + NADH （LD ）→ 乳酸 + NAD+ 在340nm 处连续监测到NADH 的消耗量，从而计算出ALT 活性浓度。 在双试剂测定中，首先使血清与缺少α -酮戊二酸的底物溶液混合，37℃保温5min，将样品 中所含的α -酮酸 （如丙酮酸）消耗完，然后加入α -